Normal Structure, Function, and Histology of the Bone Marrow

Fixation

If collected at necropsy, marrow should be collected as

soon as possible for histological assessment. Fixative solu-

tions stabilize tissue by cross-linking proteins and the degree

of cross-linking may result in denaturation of proteins and af-

fect morphological, cytochemical or immunohistochemical

qualities of the specimen. Because its readily available, 10%

neutral buffered formalin (10% NBF) is the most commonly

used fixative. For routine H&E sections, no special handling

is required prior to tissue processing. 10% NBF-fixed tissues

may be used for frozen sections and evaluation of adipocytes.

For specimens to be used for immunohistochemistry, a pro-

longed fixation in 10% NBF may be detrimental (e.g., loss

of antigenic epitopes due to continued amino group cross-

linking and alteration of tertiary protein structure). Transfer-

ring the tissue to 70% ethanol after a 12-hour fixation reduces

fixation-related effects.

Zenkers-type solutions (e.g., Zenkers-acetic acid, B5,

Helly’s) are an often recommended, but, not commonly used

fixative for bone marrow sections. These fixatives must be

made fresh prior to use and tissues must be washed prior

to processing or treated with Lugol’s iodine to remove pig-

ments. Tissues are adequately fixed in 1–2 hours but then

need to be transferred to alcohol; tissues become hard and

brittle with prolonged fixation. Fine precipitates may form in

the tissue and may become problematic when special stains

are applied (e.g., silver stains). Additionally, the fixative

constituent mercuric chloride is toxic and readily absorbed

through skin. There are zinc chloride-based, Zenkers-like fix-

atives (e.g., AZF); these have similar properties to Zenkers

fluids but no mercuric chloride. Zenkers-type fixatives are

useful for immunohistochemical procedures. And, they act as

a mordant for the Giemsa stain resulting in improved nuclear

detail.

Bouin’s solution is the preferred fixative by some investi-

gators for bone marrow sections. Tissues are fixed overnight,

followed by a 2 to 4-hour post-fixation wash (in water) and

storage in 70% ethanol. Tissues become hard and brittle with

---

560

TRAVLOS

T

OXICOLOGIC

P

ATHOLOGY

F

IGURE

11.—Bone marrow smear from a normal mouse. There is an even dispersal of hematopoietic cells admized with adipocytes and little blood contamination.

Note the size difference of the megakaryocytes (arrows) compared to the other hematopoietic cells.

prolonged fixation. The picric acid constituent stains tissues

yellow. Since Bouin’s contains acetic acid, it may be used

for decalcification; this may take an extended period of time

and requires frequent (weekly) solution changes. Delicate

morphological detail is not well preserved, but it does act

as a mordant for basic aniline dyes (e.g., H&E) improving

staining.

Decalcification

For paraffin-embedded sections, bone marrow specimens

must be decalcified prior to sectioning; specimens for plastic

embedding do not. There are numerous types of decalcifiers

(e.g., acids, chelators, resins) and methods (e.g., immersion,

sonication, microwave, ion-exchange) for the decalcification

of bone marrow specimens. If preservation of enzyme reac-

tivity or antigenic sites is required, selection of the method

of decalcification is important. With larger specimens, some

damage to tissue morphology, due to decalcification, is almost

unavoidable (especially with the use of acid decalcifiers).

Both organic and mineral acids are commonly used for de-

calcification of bone marrow specimens. Organic acids (e.g.,

formic and acetic) decalcify slower than mineral acids (e.g.,

HCL and nitric). Mineral acids are commonly used in the

rapid-type decalcification methods. Overdecalcification of

tissue with acids, particularly mineral acids, results in tis-

sue destruction. Thus, tissue in acid decalcifiers should not

be left unchecked for extended periods (e.g., over a weekend).

For proper decalcification, there must be even distribution of

acid around bone sample. Thus, tissue suspension or mild

agitation, such as gentle mixing (e.g., shaker/rocker) or air

bubble percolation, may be useful. Additionally, acid decal-

cifiers may need frequent solution changes (e.g., daily) for

adequate decalification. In general, acid decalcification is not

recommended for samples needed for enzyme- or immuno-

staining. This caveat is particularly appropriate for the min-

eral acids like HCL or nitric; the organic acids appear to

be somewhat better. All acid decalcifiers, especially mineral

acids, reduce morphological quality and Giemsa stains may

be unacceptable due to loss of basophilic-staining structures.

---

Vol. 34, No. 5, 2006

HISTOLOGY OF THE BONE MARROW

561

F

IGURE

12.—In this bone marrow smear from a normal rat, a variety of cell types includes the following: BN

=

band neutrophil; L

=

lymphocyte; MF

=

mitotic figure; MM

=

metamyelocyte; MR

=

metarubricyte; R

=

rubricyte; RM

=

ring form myelocyte; SN

=

segmented neutrophil. 13.—In this bone marrow

smear from a normal rat, multiple cell types include: BN

=

band neutrophil; MM

=

metamyelocyte; MR

=

metarubricyte; R

=

rubricyte; RM

=

ring form

myelocyte; SN

=

segmented neutrophil. 14.—Bone marrow smear from a normal rat. Mast cells (MC) are present in an admixture of mostly myeloid precursors.

15.—Bone marrow smear from a normal rat. A multinucleated megakaryocyte is surrounded by eosinophilic myeloid precursors (E) and other hematopoietic

cells.

---

562

TRAVLOS

T

OXICOLOGIC

P

ATHOLOGY

F

IGURE

16.—Bone marrow smear from a normal mouse. A macrophage (Mac) with phagocytized debris/pigment is surrounded by a prorubricyte (PR), a segmented

neutrophil (SN), and a band neutrophil (BN). A rubricyte (R) is also present. 17.—Bone marrow smear from a normal rat. A cluster of large adipocytes (center) is

surrounded by an admixture of hematopoietic cells.

Chelating agents, such as EDTA, are also commonly used

for decalcification of bone marrow specimens. Decalcifica-

tion proceeds at a slower rate compared to the acid decalci-

fiers, especially compared to mineral acids. EDTA decalci-

fication is recommended for enzyme- and immuno-staining

procedures. The action of EDTA is pH dependent (i.e., the

higher the pH, the faster the decalcification). Since a high al-

kaline pH may also cause tissue destruction and resultant

loss of cytological, enzyme or immunostaining qualities,

however, the use of EDTA at a high pH (e.g., pH 10)

T

ABLE

3.—Examples of bone marrow differential counts for the adult dog and rat