Mikrobiologiya va immunologiya

5-Mavzu. BAKTERIYALARNING GENETIKASINI O'RGANISH.


Gen zondlari usuli. Juda ko'p hollarda bakteriyalarni qiyoslashda ishlatiladi. Bu usul oddiy DNK - DNK gibridlashdan bu usul total DNKni emas, balki uning o'zida aniq genni saqlovchi (genetik marker) ma’lum fragmentini (zondini) ishlatish bilan farq qiladi.
Oldindan tekshirilayotgan bakteriyalarning “genlar banki” yaratiladi. Bu maqsadda bakteriya DNKni endonukleazalar bilan eritib, elektroforez yordamida DNK fragmentlari ajratiladi, transformasiya usulida ularning genetik xusujsiyatlari aniqlanadi, DNKning kerakli fragmenti ajratib olinadi va ligazalar yordamida vektor bo'lib xizmat qiladigan plazmidaga kiritiladi. Aniq gen bilan yaxlit holga keltirilgan plazmidni biror bir yetarlicha oson va yengil o'sadigan bakteriya shtammiga kiritiladi. Ko'p miqdorda DNK -zond saqlovchi biomassa olinadi. Plazmidli DNKni ajratib, radioaktiv izotop bilan belgilanadi, keyin bu belgilangan DNK tekshirilayotgan bakteriyaning DNKsi bilan gibridlanadi. Autoradiografiya usulida markerning tekshirilayotgan DNK bilan gibridizasiyasini nisbiy chastotasini aniqlab, shu ko'rsatkich orqali aniq bakteriya - DNK donori va tekshirilayotgan bakteriyaning genetik-yaqinligi fikrlanadi.
Polimerazali zanjirli reaksiya - PZR (polymerase chain reaction -PCR). Reaksiyaning prinsipi shundan iboratki, DNK - polimeraza yordamida in vitro juda ko'p qayta - qayta DNKning ma'lum qismi nusxalari sintezlanadi (amplifikasiya-to'planish).
PZR - siklik jarayon bo'lib, har bir sikli uch bosqichdan iborat.
1 .Tekshirilayotgan DNKni issiqda (95°Cda) denaturasiya qilish. Bunda juft asoslarni biriktirubchi vodorod bog'lar parchalanib, DNK zanjirlari tarqab ketadi, ya'ni bir zanjirli DNK hosil bo'lib praymeronlar DNK polimerazalar kirishi uchun yengillik paydo qiladi. Jarayonning davomiyligi 1 daqiqa.
2. Praymerlarni DNKni ikkita antiparallel zanjirlarining komplementar qismlariga o'tkazish (yumshatish). Praymerlar 20 - 30 nukleotidlardan iborat ikkita sintetik oligonukleotidlardir. Ularning har biri qo'zgatuvchi DNKsi tanlab olingan chegaralangan segmentlari qismida qarama - qarshi DNK zanjirlariga komplementar bo'ladi. Demak, praymerlar qo'zg'atuvchi uchun maxsus bo'lgan DNK qismini chegaralaydi. Praymerlar reaksiya aralashmasiga keragidan ortiq qo'shiladi, bu ularga bir zanjirli DNKlar ikki zanjirliga birikishidan (renaturasiya) avval o'zining komplementar qismlarini egallashiga imkon beradi. Bosqichning davomiyligi 1 - 2 daqiqa.
3. Praymerni DNK - polimeraza ishtirokida peaksiya aralashmasiga qo'shilgan dezoksinukleozidtrifosfatlardan tuzilib bitish jarayoni (elongasiya). Odatda termofil bakteriya Thermus aquaticus (Tag -polimeraza)ning termostabil DNK- polimerazasi qo'llanadi, u polimerizasiyani optimal haroratlarda 70 - 75°C olib borishga imkon beradi. DNK sintezida praymerlar uning molekulasiga kiradi. Polimeraza yordamida DNK sintezi faqat praymerlar orasida kechadi. Bunda DNKning aynan o'sha qismini nusxalari soni ikki hissa ortadi. Bitta praymer yordamida sintezlangan DNK molekulasi boshqa praymer yordamida (komplementar DNK sintezi uchun matrisa bo'lib xizmat qilishi mumkin. Bu bosqichning davomiyligi 1 -2 daqiqa.
Birinchi sikl tugashi bilan reaksiyani to'xtatib, DNKni yana harorat bilan denaturasiya qilinadi. Sovutganda ortiqcha praymerlar yana boshlang'ich va yangi sintezlangan DNK zanjirlari biian gibridlanadi. DNK - polimerazani qo'shganda polimerizasiyaning ikkinchi siklini ta'minlaydi. Shu tariqa praymerlarning fermentativ uzaytirishini bir necha o'nlab sikllarini o'tkazish mumkin. Natijada ikki tarafidan praymerlar bilan chegaralanlgan DNK segmentlarining soni har siklda eksponensial ko'payadi: Demak, PZR usulini qo'llab, in vitro preparatni DNK fragment bilan tanlab aniq ketma - ketlikda million va undan ko'p marta boyitish mumkin. DNK fragmentlari sonining ko'payishi tekshirilayotgan namunada gomologik DNK ya'ni infeksion kasallik qo'zg'atuvchisi borligini isbot qiladi.
PZRni amaliyotda ishlatish uchun DNK matrisani nusxasini takrorlovchi zanjirning uchta uchlariga komplementar va nusxasi. olinadigan DNK fragmentlarini chegaralovchi praymerlarni sintezlash kerak. Ular qo'zg'atuvchi genomini nukleotidlar ketma - ketligi passhifrovka qilingan va genetik o'zgarishlarga chidamli qismlari asosida tanlanadi. Masalan, C. psittaci qiyoslash uchun tashqi membrana oqsilini kodlashtiruvchi genlar asosida yoki 16s rRNK kodlashtiruvchi genlar asosida tanlangan praymerlar taklif etilgan. Brusellalarni qiyoslash uchun praymer 31 KDa tashqi membranasi oqsilini kodlashtiruvchi gen asosida tanlangan va h.k.
PZR - diagnostikani o'tkazish uchun quyidagi komponentlar kerak: to'rt xil tipdagi dezoksitrifosfatlarning suvdagi eritmalari (dATF, dTTF, Dstf, 10 mM, pH 7,0); birinchi praymer (5 mM); ikkinchi praymer (5 mM); Taq - polimeraza fermenti (5 TB/mkl); amplifisirlanadigan DNK (- 1 mkg) Mg⁺²ionlari (25 mM) polimerazaning ishini ta'minlash uchun; buferli eritma (10 baravarli konsentrat), masalan, qoramol albumini va ionsiz detergentlar qo'shilgan uchlantirilgan xlorid kislota (pH 6,8 - 7,7 ).
Ko'rsatilgan komponentlar masalan quyidagi miqdoriy nisbatlarda probirkalarga solinadi: dezoksinukleozidtrifosfatlar - 8 mkl, buffer - 10 mkl, amplifisirlanadigan DNK - 1 mkg, praymerlar -1-5 mkl dan.; polimeraza - 0,5 mkl, distillangan suv - 100 mkl gacha. Bug'lanishning-oldini olish uchun probirkadagi suyuqlik ustiga mineral yog' quyiladi. PZRni o'tkazishning birinchi bosqichida DNK denaturasiyalanadi, keyin dezoksinukleozidtrifosfati bor reaksiya aralashmasiga polimeraza quyib, amplifikatorga yoki termosikler (programmalasuvci termostat) ga solinadi. Amplifikasiya termosiklerda berilgan programmada o'tkaziladi, masalan: 90°C - 1 daqiqa, 60°C - 1 daqiqa, 72°C - 1 daqiqa (5 sikl), 93°C - 1 daqiqa, 57°C - 1 daqiqa, 92°C - 1 daqiqa (5 sikl), 93°C - 1 daqiqa, 55°C - 1 daqiqs 72°C - 3 daqiqa (25 sikl).
Amplifikasiya tugaganidan keyin PZR mahsulotlari ya'ni amplifikonlarni aniqlash bosqichi keladi. DNK molekulalari va ularning fragmentlari agar gelida elektroforez bilan ajrafiladi. Gelda DNK etidiy bromidi bilan bo'yaladi. so'ng ultrabinafsha nurlari ostida foregrammalar analiz qilinadi, rasmi olinadi. Amplifikasiyalangan DKK chiziqlarining maxsusligi belgilangan fragmentlar va standart DNKga nisbatan taqqoslash bilan tasdiqlanadi. Qo'shimcha ravishda amplifikonlarning maxsusligini maxsus radioaktiv zond bilan gibridlash yo'li orqali tasdiqlash mumkin.
PZRda qo'zg'atuvchi kulturasi,. qo'zg'atuvchisi bor to'qimalar tekshirish ob'ekti bo'lishi mumkin. Materialdan biror bir usuida DNK ajratib olinadi. Materiaining xarakteriga bog'liq ravishda unga ishlov berish usullari har xil bo'ladi.
Infeksion kasallik qo'zg'atuvchilarini aniqlash yoki o'stirish qiyin bo'lgan yoki tipik bo'lmagan shaklli (L - shakl ) bakteriyalarni topishda, shuningdek mikroorganizmlarning biror patogenlik faktorlarini nazorat qiluvchi genlarini aniqlashda PZR - diagnostikasining yutug'i katta.
Kundalik diagnostik amaliyotda odatda mikroorganizmlarning patogenligini aniqlash bilan chegaralanadi; biopreparatlarni baholashda hayvonlarni zararlash uchun olingan mikroorganizmiar virulentligining miqdoriy xarakteristikalari kerak.