Mavzu: Kapillyar elektroforez usulida dori vositalari taxlili

Toshkent farmaseftika instituti MSMSM 301-A gruh talabasi Bahromqulov Shaxbozbekning mustaqil ishi
Tekshirdi Murodova Nigina
MAVZU: Kapillyar elektroforez usulida dori vositalari taxlili
Reja:

1. 
   Kapillyar elektroforez
   
2. 
   Kapillyar elektroforez qullanilishi
   
3. 
   Kapillyar elektroforez turlari
   
4. 
   Kapillyar elektrofozrez usulida dori vositalari taxlili
   

Kapillyar elektroforez (KE) – ionlar va boshqa zaryadlangan

zarrachalarning elektrokinetik hodisalar – elektromigratsiya va elektroosmos
vositalari yordamida murakkab tarkibli aralashmalarni komponentlarga ajratish
va aniqlash usulidir. Ushbu jarayonlar eritmalarda yuqori kuchlanishli elektr
maydon ta‘sirida amalga oshiriladi. Bunda eritma ingichka kapillyar (masalan
kvarsdan tayyorlangan) ichida bo‗lib, u orqali elektr toki o‗tkazilganda
zaryadlangan zarrachalar harakatga kelib, suyuqlikning harakatlanishi
kuzatiladi. Bunda har xil zarrachalarning harakat tezligi turlicha bo‗lganligi
sababli ular bir-biridan ajraladi. Ushbu jarayonda diffuziya, sorbsiya,
konveksiya, gravitatsiya kabi omillarning ta‘sirida murakkab aralashma
komponentlarining o‗zaro ajralishi yanada kuchayadi.
KE tahlil usulida qo‗llaniladigan asboblar quyidagi asosiy qismlardan
tashkil topgan: avtosampler (namunani avtomatik kiritish qismi), detektor, yuqori kuchlanish bloki, kapillyar va butun jarayonlarni boshqarish uchun
maxsus dastur hamda kompyuter.
KE da kuchlanish yuqori samarali suyuqliq xromatografiyasidagi (YUSSX)
nasos, kapillyar esa kolonka vazifasini bajaradi. KE tahlil usulining umumiy
tamoyillari YUSSX bilan yaqin. Bunda asbobni boshqarish dasturlari ham
deyarli bir xil bo‗lib, ko‗pchilik KE tizimlari oldindan mavjud bo‗lgan suyuqlik
xromatograflari uchun ishlab chiqilgan dasturlar asosida boshqariladi.
KE asbobining asosiy tarkibiy qismlari 1 - rasmda keltirilgan.
1- RASM. KE ASBOBINING CHIZMA TASVIRI
KE tahlil usulida moddalarning bir-biridan ajralishi ingichka kapillyar
(diametri 25-100 mkm) ichida sodir bo‗ladi. Ushbu kapillyarning oxirlari yuqori
kuchlanish manbaiga ulangan bufer eritmalar saqlovchi idishlarga tushirilgan
holda bo‗ladi.
Bufer eritma bilan to‗ldirilgan kapillyarning tuzilishi 2 – rasmda keltirilgan.
KE da aralashma komponentlarining ajralish jarayoni kapillyar ichida turli
rN ko‗rsatkichli bufer eritma muhitida sodir bo‗ladi. Bufer eritma kapillyar
devori orasidagi qatlam 3 qavatdan iborat bo‗ladi: manfiy zaryadlangan
kapillyar devori, turg‗un va diffuzion qavatlar.
KE tizimsida bufer eritma bilan to‗ldirilgan oddiy kvars kapillyarlarda
odatdagi tahlillar olib borishda kapillyar ichki devori yuzasidan bufer eritmaga
silanol guruhlardan proton ajralib chiqish hisobiga ushbu yuzada manfiy zaryad
hosil bo‗ladi. Mazkur jarayon hatto juda past rN ko‗rsatkichlarida ham
kuzatiladi. Bunda kapillyar ichidagi kationlar yoki qisman musbat zaryadlangan
zarrachalar elektrostatik ravishda manfiy zaryadlangan kapillyar devoriga
tortiladi va ikki xil zaryadlangan qavatni hosil qiladi. Elektroforez jarayoni
butun kapillyar bo‗ylab hosil bo‗lgan ikki qavatli elektr qavati orqali tok
o‗tkazish orqali amalga oshiriladi. Bunda eritma kapillyarning manfiy
zaryadlangan oxiri - katodga tomon harakatlanadi.
Tekshiriluvchi namunani kapillyarga kiritish rezervuarlaridan birini (odatda
anod tomondagi) tekshiriluvchi namuna eritmasini saqlovchi rezervuarga
vaqtincha almashtirish bilan olib boriladi. Namunani kapillyar ichiga kiritish
elektrokinetik yoki gidrodinamik usulda amalga oshiriladi (3 - rasm).
KE tahlil usulining asosiy kamchiliklaridan biri kapillyarga kiritiluvchi
tekshiriluvchi namuna miqdorining aniq bo‗lishini ta‘minlashning
murakkabligidir. CHunki bunda ushbu hajm 1 – 20 nl ni tashkil qilib, u
tekshiriluvchi eritma harorati, qovushqoqligi va berilayotgan elektr tokining
(elektrokinetik usulda) yoki bosimning (gidrodinamik usulda) aniqligiga
bog‗liq.
3 - rasm. Namunani kapillyarga kiritish usullari
Ushbu keltirilgan murakkabliklarga qaramasdan zamonaviy KE
qurilmalarida kapillyar ichiga kiritiladigan namuna hajmidagi xatolik 1% dan
oshmasligiga erishish mumkin.
YUqorida aytib o‗tilganidek, KE da sodir bo‗ladigan asosiy hodisalardan
biri - elektroosmotik oqim (EOO) hisoblanadi.
Manfiy zaryadlangan kapillyar devori bufer eritma tarkibidagi musbat
zaryadlangan ionlarni o‗ziga tortib, ikki xil zaryadli qo‗sh qavatni hosil qiladi.
Kapillyar oxirlariga kuchlanish berilganda diffuzion qavatdagi kationlar katod
tomonga harakatlanib, o‗zi bilan birga suv molekulalarini ham harakatga
keltiradi. Buning natijasida bufer eritma oqimi manfiy zaryadlangan katod
tomonga harakatlanadi. Ushbu hosil bo‗lgan oqim EOO deb nomlanadi va u
osonlik bilan hosil qilinishi mumkin. l uchun, konsentratsiyasi 20 mM bo‘lgan boratli bufer (rN 9.0)
elektroosmotik oqimining chiziqli tezligi taxminan 2 mm/s tashkil qiladi. Ichki
diametri 50 mkm bo‘lgan kapillyar uchun ushbu oqim taxminan 4 nl/s tashkil
qiladi. YUqorida keltirilgan tahlil sharoitlarida pH=3 da EOO birmuncha
kichik bo‘ladi va taxminan 0,5 nl/s tashkil qiladi.
KE da aralashma komponentlarining bir-biridan ajralish mexanizmi
moddalarning bufer eritmada kapillyar bo‗ylab harakatlanish tezliklaridagi
farqqa asoslanadi.
KE da elektroforezning boshqa ko‗rinishlaridagi kabi EOO dan tashqari
elektroforetik oqim (EFO) ham mavjud bo‗lib, bunda manfiy zaryadlangan
zarrachalar anodga, musbat zaryadlangan zarrachalar esa katodga tomon
harakatlanadi. SHunday qilib, EFO musbat zaryadlangan zarrachalarni EOO ga
qarama-qarshi tomonga harakatlanishga sabab bo‗ladi. Lekin bunda EOO tezligi
EFO nisbatan ancha yuqori bo‗lib, shu tufayli ham kationlar ham anodga tomon
harakatlanadi.
KE da aralashma komponentlarining taqsimlanishi quyidagicha bo‗ladi:
Kationlar → Neytral zarrachalar → Anionlar
Bundan ko‗rinadiki, kationlarning harakat tezligi zaryad/massa nisbatiga
to‗g‗ri, anionlarda esa teskari proporsional. Neytral zarrachalarning tezligi esa
ularning o‗lchamlariga teskari proporsional bo‗ladi.
SHunday qilib, murakkab aralashma tarkibidagi anion, kation va neytral
zarrachalar bir vaqtning o‗zida bir-biridan ajralishi mumkin.
Suyuqlik xromatograflariga o‗xshash bosimni boshqarish mumkin bo‗lgan
tizimlarda suyuqlik va qattiq faza (sorbent va kapillyar devori yuzasi) orasidagi
ishqalanish kuchlari bosimning katta sakrashlariga olib keladi. Bunda ochiq
kapillyar va kichik oqimda ham ishqalanish kuchlari etarli darajada katta bo‗lib,
u laminar yoki parabolik oqimning hosil bo‗lishiga olib keladi. kapillyar ichida
hosil bo‗lgan parabolik oqimning tezligi kapillyar markazida eng yuqori bo‗lib,
uning devori yaqinida nolga yaqinlashadi (4- a rasm).
Bu esa oqim zonasining kattalashishiga olib keladi. Bundan farqli ravishda
EOO tekis bo‗ladi. Elektrokinetik tizimlarda suyuqlikni harakatga keltiruvchi
kuch EOO kapillyarning butun ichki yuzasi bo‗ylab bir xilda taqsimlangan.
Buning natijasida kapillyar devori yuzasiga juda yaqin bo‗lgan sohadan tashqari
butun diametr bo‗yicha bir xil bosim va tezlikka ega bo‗ladi (4-b rasm) KE tahlil usulida moddalarni bir-birdan ajratishda EOO muhim rol
o‗ynaydi. SHu sababli qaytalanuvchan natijalar olish uchun EOO ning bir xilda
bo‗lishi lozim.
EOO ga ta‘sir ko‗rsatuvchi asosiy omillardan biri muhit rN ko‗rsatkichi
bo‗lib, uning o‗zgarishi tufayli kapillyar ichki devorining zaryadlanishiga ta‘sir
ko‗rsatadi (5 - rasm). rN ko‗rsatkichining o‗zgarishi moddalarning ajralishi,
selektivlikka, elektroforetik cho‗qqi shakliga, tahlil qilinayotgan modda
zaryadlanish darajasiga va EOO tezligiga ta‘sir ko‗rsatadi. To‗ldirilmagan va
modifikatsiyalanmagan kvars kapillyarda EOO tezligi eritma rN ko‗rsatkichiga
to‗g‗ri proporsional bo‗ladi.
YUqori rN ko‗rsatkichida kapillyar devorlarining zaryadlanish darajasi
oshib, EOO ning oshishiga olib keladi. Bunda aralashma komponentlarining
tezligi juda yuqori bo‗lib, ular bir-biridan ajralishga ulgurmasdan kapillyardan
yuvilib chiqishi mumkin.
5 - rasm. Muhit rN ko„rsatkichining elektroosmotik oqimga ta‟siri
Aksincha, past rN ko‗rsatkichida manfiy zaryadlangan kapillyar devorlari
kationfaol moddalarni kulon kuchlari ta‘sirida adsorbsiyalab, ularning kapillyar
bo‗ylab harakatlanishini qiyinlashtiradi va tahlil vaqtining uzayishiga olib
keladi.
Moddalarni bir-biridan ajratishning maqbul sharoitlari eritma rN
ko‗rsatkichi, qo‗llanilayotgan tok kuchi, bufer eritma tarkibi va
konsentratsiyalarini optimallashtirish orqali amalga oshiriladi.
KE ning 5 ta asosiy variantlari mavjud:
1. Kapillyar zonal elektroforez (KZE)
KZE da moddalarning bir-biridan ajralish jarayoni aralashma individual
komponentlarining elektroforetik harakatchanliklari turli xilda bo‗lishiga
asoslangan. Ushbu farq tahlil qilinayotgan modda molekulalari o‗lchamlari va
zaryadlangan darajasi hamda tahlilning mahsus sharoitlariga bog‗liq. Ushbu KE
variantida tahlilning optimal sharoitlari asosan bufer eritma tarkibi, uning rN
ko‗rsatkichi va konsentratsiyasini o‗zgartirish orqali amalga oshiriladi.
2. Mitsellyar elektrokinetik xromatografiya (MEKX)
MEKX da bufer eritmaga ionlanuvchi surfaktantlar qo‗shilib, ularning
miqdori mitsella hosil qilish kritik nuqtasidan yuqori bo‗ladi. Bunda hosilo‗lgan mitsellalar ―yolg‗on statsionar faza‖ vazifasini bajarib, ularda tahlil
qilinayotgan modda molekulalari taqsimlangan bo‗ladi. Ushbu mexanizm
qutbsiz va zaryadlangan zarrachalarni bir-biridan ajratishda qo‗llaniladi.
3. Kapillyar gel-elektroforez (KGE)
KGE gel-filtratsiya tahlil usuliga o‗xshash. Bunda moddalarni ajratish
uchun gel bilan to‗ldirilgan kapillyarlar ishlatiladi. Bunda ajralish jarayoni
molekulalarning o‗lchamlari va molekulyar massasiga bog‗liq. Ushbu tahlil
usuli, asosan, oqsil moddalari, peptidlar va oligomerlar tahlilida ishlatiladi.
Gellar EOO ni kamaytirish bilan birga oqsil moddalaring kapillyar devorlariga
absorbsiyalanishini kamaytirishi sababli tahlil qilinuvchi moddalar
cho‗qqisining ―dum‖ining qisqarishiga sabab bo‗ladi.
4. Kapillyar izoelektrik fokuslash (KIEF)
KIEF da bir-biridan ajratilgan zonalarda joylashgan ikkita bufer eritma
ishlatiladi. Bunda bir vaqtning o‗zida anionlar va kationlar tahlil qilinishi
mumkin. Bundan tashqari tahlil qilinuvchi moddalar konsentratsiyasi zonalar
bo‗yicha bir xil bo‗lib, ushbu zonalarning kengligi modda miqdoriga bog‗liq
bo‗ladi.
5. Kapillyar izotaxoforez (KITF)
KIEF kabi tahlil qilinuvchi ionlarni ikkita bufer eritma orasida ajralishiga
asoslangan. Bunda kapillyar boshqa barcha ionlarga nisbatan katta
harakatchanlikka ega bo‗lgan tashuvchi elektrolit bilan to‗ldirilib, unga tahlil
qilinuvchi namuna eritmasi kiritiladi. SHundan keyin kapillyar tahlil qilinuvchi
moddalarga nisbatan kam harakatchanlikka ega bo‗lgan bufer eritmaga
tushiriladi. Kapillyar orqali elektr toki o‗tkazilganda anionlar anod tomonga
harakatlanadi. Bunda tashuvchi elektrolit hammadan tez harakatlanadi. Tahlil
qilinuvchi ionlar o‗z harakatchanliklariga mos ravishda turg‗un zonalarga
ajraladi. Bunda bir vaqtda faqat kationlar yoki anionlar tahlil qilinishi mumkin.
Eng keng qo‗llaniladigan KE variantlari KZE va MEKX bo‗lib, ularning
qisqacha tavsifi quyida keltirilgan.
KZE ning asosiy tamoyillari
KZE da zaryadlangan zarrachalarning o‗zaro ajralishida elektoosmos va
elektroforez tamoyillariga asoslangan.
1. Ionning elektroforetik xaraktchanligi, µEP, quyidagi formula bilan
tavsiflanadi:
r
q
ЕР


6

;
Bu erda q – ion zaryadi, η - eritma qovushqoqligi, r – gidratlangan ion
radiusi.
Ushbu tenglamaga asosan kichik o‗lchamli va katta zaryadli ionlar yuqori,
katta o‗lchamli va kichik zaryadli ionlar esa kam harakatchanlik xossasiga ega
bo‗ladi.
2. Ko‗chish tezligi, υER, sm/sek quyidagi tenglama bilan tavsiflanadi:
( ) KE tahlil usulining dori moddalari tahlilida qo„llanilishi
7- rasm. Paratsetamol (1), kofein (2) va 4-gidroksiatsetofenon (3) (ichki
standart) larni MEKX usulida aniqlash
Tahlil sharoitlari: Beckman P/ACE KE asbobi; elektrolit- 40 mM dinatriy
tetraborat, 125 mM natriy dodetsilsulfat; detektrlash - 210 nm; kapillyar,
kvarsdan tayyorlangan, o‗lchamlari: uzunligi 72 cm, ichki diametri 50 mkm;
harorat – 40° C.