Лабораторные работы по предмету микробиология, вирусология и иммунология

Определение титра вирусов в РГА.
РГА применяется для определения титра вируса в аллантоисной жидкости куринного эмбриона и при идентификации вируса.
РГА для определения титра вируса

Разбавленный вируссодержащийматериал	1/2	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	1/128	Контроль эритроцитов
1% суспензия эритроцитов кур	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4 + ф/р
Полученные результаты РГА+/─	++++	++++	++++	++++	+++	++	+	─

По таблице видно, что титр вируса в аллантоисной жидкости 1/64, рабочая доза для РТГА равна 1/32.

Идентификация вирусов (определение типа вируса).
Реакция нейтрализации (РН) основана на способности специфических АТ прочно соединятся с вирусом (АГ). В результате взаимодействия происходит нейтрализация инфекционной активности вируса вследствие блокады антигенных детерминант. В результате вирус утрачивает способность размножаться в чувствительной биологической системе. Для постановки реакции выделенный вирус накапливают в культуре ткани, делают разведение и смешивают вирусы с не разведенной противовирусной сывороткой. Полученную смесь помещают в термостат, инкубируют в течение 1 – 2 часов при 37º или при 4º – 18 часов. После этого инкубированную смесь помещают в культуру клеток, о нейтрализующей силе судят по отсутствию ЦПД на клетки. Одновременно вычисляют индекс нейтрализации , выражающее максимальное количество смертельных доз вируса, которое нейтрализуется данной сывороткой по сравнению с результатами контрольного опыта.
Её результат определяется следующими:
1. нейтрализация цитопатического действия
2. нейтрализация реакции гемадсорбции.
3. изменения цветной реакции.
4. торможение реакции гемагглютинации.
5. определением нейтрализации на экспериментальных жывотных
Кроме этого для идентификации вирусов применяются иммунофлюресценция и методы ДНК-ДНК(РНК-РНК) гибридизации.
Таблица №2
Определения типа вируса методом РТГА.
В практике применяется для определения типов вирусов, содержащих гемагглютинин (ортомиксовирус, парамиксовирус).
РТГА для определения типов вирусов.

Разбавленная диагностическая сыворотка		Исследуемые						Контроли
		1/10	1/20	1/40	1/80	1/160	Сыворотка		Вирус		Эритро-циты
1		0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2		─		─
2		0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2		─		─
3		0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2		─		─
Рабочая доза вируса (1/32)		0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	─		0.2		─
1% суспензия эритроцитов кур		0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2		0.2		0.2
Хранится 60 мин при комнатной темп.
Полученные результаты РГА +/─	1	+	+	+	+	+	─			+	─
	2	─	─	─	─	─	─			+	─
	3	+	+	+	+	+	─			+	─

Из эксперимента видно, что вирус в аллантоисной жидкости нейтрализуется диагностической сывороткой 2-го типа в соотношении 1:10 – 1:160, то есть вирус относится к этому типу.
Лабораторная работа. Постановка РГА.
Цель: Определить наличие вируса в аллантоисной жидкости, индикация вируса.
Необходимое оборудование:вируссодержащая аллантоисная жидкость (в двух пробирках), 1 % взвесь эритроцитов (в трех пробирках по 5,0 мл), штатив (3 шт.), пробирки, планшет (3 комплекта), пипетки Пастера, резиновый груши (6 комплект), физ. раствор, 96^о спирт (20 мл)

Последовательность

№	Выполняемые действия	Не выполнил	Выполнилправильно (балл)
1	Берется зараженныйкуринный .эмбрион	0	5
2	С помощью стерильной пипеткой Пастера берется аллантоисная жидкость из эмбриона	0	20
3	Аллонтоисную жидкость разбавлают от 1/2 до 1/512 в пробирках или в планшетах	0	20
4	В контрольную пробирку наливают незараженную аллантоисную жидкость и физ.раствор.	0	5
5	В каждую пробирку капают по 0,2 мл, а в планшеты 0,1 мл 1% ных куринных эритроцитов отмытых в физ.р=ре центрифугированием.	0	10
6	Пробирка или планшет оставляют в течение 40 мин при комнотной температуре.	0	5
7	Через 40 мин. изучается результат реакции: положительная - на дне пробирки можно увидеть тонкую пленку в виде зонтика, соединенную эритроцитами. Определяется титр вируса по наличию полного или неполного зонтика	0	25
8	Полученный результат записывается в тетрадь в виде протокола. Иследуемые пробирки и планшеты оставляются в холодилник на 6-12 часов и проводится окончательный учет результатов.	0	10
Всего		0	100

Рисунок 73.
Лабораторная работа. Постановка РТГА.
Цель: Провести идентификацию вирусов методом РТГА.
Необходимое оборудование:вируссодержащая аллантоисная жидкость (в двух пробирках), 1 % эритроциты (в трех пробирках по 5,0 мл.), диагностические сыворотки (HON1, H2N2,H3N2) (по одной пробирке), штатив (3 шт.), пробирки, планшет (3 комплекта), пипетки Пастера, резиновая груша (6шт), физ. раствор, 96^о спирт (20 мл)

Последовательность

№	Выполняемые действия	Не выполнил	Выполнил правильно (балл)
1	в 3 ряда пробирки или планшета разводятся диатностические сыворотки (HON1, H2N2,H3N2) от 1/2 до 1/128	0	20
2	Берутся 3 контрольные пробирки: 1-ая для сыворотки, 2-ая для вируса , 3- физ.р-р	0	10
3	Во все пробирки по 0,2 мл, а в лунки планшетапо 0,1 мл рабочей дозы (1/128) вируса и в контрольную для вируса.	0	20
4	Во все пробирки по 0,2 мл, в планшет по 0,1 мл добавляется 1% суспензия эритроцитов кур	0	20
5	Оставляют на 60 мин при комнатной температуре	0	10
6	Изучается полученный реаультат, записывается протокол в тетрадь. Иследуемые пробирки и планшеты оставляются в холодилник на 6-12 часов, затем проводиться окончательный анализ результатов.	0	20
Всего		0	100

Рисунок 74. Полученные результаты показывают, что пробирки во втором ряду 1/128 полностью нейтрализованы Н2N2. Изучаемый вирус - Н2N2.


ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №19
«ПРИГОТОВЛЕНИЕ НАТИВНОГО И ОКРАШЕННОГО ПРЕПАРАТА ИЗ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГРИБОВ».
Цель работы
- Изучение методов нахождения грибов из патологического материала методом микроскопирования.
. Задачи педагога:
- Ознакомить студентов с видами грибов, которые способны вызывать инфекционные заболевания, и объяснить проявления грибковых патологий у человека;
- Ознакомить студентов с техникой взятия патологического материала и методами диагностики этих инфекций, механизмами, анализом результатов и применением их на практике.
Результаты занятий
Студент должен знать:
- о микроскопических грибах, которые вызывают инфекционные заболевания у людей и виды грибковых патологий у человека;
- микробиологические методы диагностики, которые легко применить на практике, их механизм, анализ результатов и использование в своей деятельности;
Студент должен уметь:
- взять патологический материал у пациентов с грибковыми инфекциями
- приготовить мазки – нативный и окрашенный, проводить микроскопию;
- анализировать полученные результаты;
- применить на практике полученные результаты.
Теоретическая часть
В настоящее время грибковые инфекции – одна из важнейших проблем здравоохранения. Грибы, имеющие медицинское значение, представляют многочисленную группу возбудителей,  вызывающих микозы. Из огромного количества грибов около 50 видов – патогенные, большое количество видов относится к условно-патогенным.
Медицинская микология относится до настоящего времени втени бактериологии и вирусологии, однако, грибковые поражения относятся к числу наиболее распространенных инфекций человека. По данным ВОЗ, каждый пятый житель планеты поражается грибковой инфекцией, и только 5% всех микозов являются первичными инфекциями, а в остальных случаях – это вторичные процессы, которые развиваются на фоне основных расстройств различного генеза. Увеличивается рост заболеваемости дерматомикозами на фоне возрастающих иммунодефицитов, нейтропений, ВИЧ-инфекции, множественной антибиотикотерапии, учащаются случаи глубоких оппортунистических микозов; расширяется спектр возбудителей, появляются новые нозологические формы, возрастает устойчивость грибов к противогрибковым препаратам. Большое влияние на здоровье человека оказывают последствия воздействия грибов и продукты их жизнедеятельности, такие как микогенная аллергия и микотоксикозы.
Грибковые инфекции можно подразделить на контагиозные и оппортунистические. Контагиозные микозы - чаще эндемичные инфекции.
Особую тревогу вызывают рост оппортунистических системных микозов, которые обычно возникают на фоне основного заболевания, осложненяя его течение. К классическим оппортунистическим системным микозам относят: системный кандидоз, криптококкоз, аспергеллёз, пенициллиоз, зигомикоз и др. Глобальными проблемами являются увеличение частоты инвазивных микозов и увеличение доли микозов среди ВИЧ-инфицированных. Возросла роль грибов в возникновении внутрибольничных инфекций. Особенно заметна их возрастающая роль в трансплантологии, онкогематологии, неонатологии.
В настоящее время перед медицинской микологией стоит серьёзная проблема – совершенствование методов лабораторных исследований, т.к недостаточная информативность лабораторных данных часто бывает причиной поздней или неправильной интерпретации результатов исследования, что создаёт трудности в лечении и приводит к развитию хронического течения заболевания. Ранняя диагностика значительно увеличивает шансы на успешное выздоровление, поэтому необходимо с самого начала, предполагая возможность грибковой инфекций, провести микологическое исследование больного. Современные методы обнаружения глубоких микозов позволяют глубоко изучать их поведение в пораженных тканях, что необходимо для дифференциальной диагностики грибов.
Развитие молекулярно-генетических, биохимических и иммунологических технологий нашло широкое применение в лабораторной диагностике грибковых инфекций. Совершенствуются методы индикации микотоксинов, диагностики, лечения и профилактики микотоксикозов и токсикоинфекций грибковой этиологии.
Работа с патологическим материалом, содержащим грибы, должна проводиться особых правил техники безопасности, противоэпидемиологического режима, личной гигиены и быть направлена на обеспечение профилактики заражения, аллергизации населения и распространения инфекций. В связи с этим микологические исследования должны проводиться в специализированных лабораториях.