Лабораторные работы по предмету микробиология, вирусология и иммунология

I-уровень иммунологической оценки состоит из следующих показателей:
1) оценка абсолютного и относительного количества лимфоцитов в периферической крови.
2) определение абсолютного и относительного количества Т- и В- лимфоцитов по тесту Е и ЕМ –розеткообразования .
3) определения общего количество основных иммуноглобулинов в сыворотке крови (G, M, А)
4) изучения фагоцитарной активности нейтрофилов.
Если при оценке состояния ИС по I-уровню не выявляются нарушения, то оценка продолжается по II-уровню.
Для оценки Т- и В- лимфоцитов основном показателем считается общее количество лимфоцитов. И поэтому выделение чистой популяции лимфоцитов считается важным.
Выделение лимфоцитов по градиенту плотности фикол-верогрофин.
1. Для исследования берется венозная кровь (2-5мл), наливается в пробирку с гепарином (25 ед/мл). Полученную кровь можно 2-3 раза
2.В пробирку с гепариновой кровью (1-1,5 мл) медленно по-слойно по стенке наливается фиколл-верографин с градиентом плотности 1,077. Соотнашение между кровью и градиентом плотности 1:3.



Рисунок 66. Выделение лимфоцитов из периферической крови по градиенту плотности
3. Пробирка центрифугируется 30 мин с оборотом 1500.
4.Лимфоциты, образовавщие кольцо в интерфазе выделяются пипеткой Пастера и промываются 2 раза в среде 199 центрифугированием 800 об/мин в течение 10 минут.
Готовится мазок и подсчитывается количество лимфоцитов на камере Гараева, количество доводится до 2 млн в 1 мл крови.
Перед использованием лимфоцитов изучается их жизнеспособность. Для этого с помощью пипетки Пастера берется суспензия и готовится мазок на предметном стекле. Затем к нему добавляется 1% ный раствор трипанового синего и закрывается покровным стеклом. После 2-3 минуты под микроскопом подсчитывается до 100 лимфоцитов (мертвые лимфоциты окрашиваются в синий цвет). Живых не должно быть менее 95%.
Определение Т-лимфоцитов методом Е – розеткообразования с эритроцитами барана.
1. На 0.1 мл смеси лимфоцитов добавляется 0,1 мл 1% эритроцитов барана. Смесь ставится в термостат на 5 минут при 37^ОС. Далее центрифугируется со скоростью 800 оборотов/мин в течение 5 минут и ставится в холодильник на 30-60 мин в при темп. 0-4 ^ОС.
2. Жидкость с верхней части раствора с осторожностью удаляется пипеткой Пастера и осадок в пробирке очень медленно перемешивается. Добавляется 2,5% остуженного глютар-алдегида, до концентрации 0,6%. Оставляется при комнатной температуре в течении 10 минут.



Рисунок 67. Выделение Т-лимфоцитов из периферической крови методом Е-РОК
3. Готовится мазок из осадка, фиксируется в метиловом спирте в течение 10 мин. и окрашивается методом Романовского-Гимза.
4. Под иммерсионным объективом светового микроскопа подсчитываются до 100-200 лимфоцитов. Розеткообразующими считаются Т-лимфоциты, которые прикрепляют к себе 3 и более бараниньих эритроцитов. У здоровых людей популяция этих лимфоцитов составляет 50-70% процентов.