Курсовая работа кинетика ферментативных реакций

2.5 Ингибирование ферментов

Существуют реагенты, способные взаимодействовать более или менее специфично с той или иной боковой цепью белков, что приводит к ингибированию активности фермента. Это явление позволяет изучать природу аминокислотных боковых остатков, принимающих участие в данной ферментативной реакции. Однако на практике следует учитывать многочисленные тонкости, делающие однозначную интерпретацию результатов, полученных со специфическими ингибиторами, довольно трудной и зачастую сомнительной. Прежде всего, чтобы реакция с ингибитором подходила для изучения природы участвующих в реакции боковых цепей, она должна удовлетворять следующим критериям:

1) быть специфичной, т.е. ингибитор должен блокировать только нужные группы;
2) ингибировать активность фермента, и это ингибирование должно становиться полным при увеличении числа модифицированных групп;
3) реагент не должен вызывать неспецифическую денатурацию белка.
Выделяют 2 группы ингибиторов: обратимого и необратимого действия. В основе подразделения лежит критерий восстановления активности фермента после диализа или сильного разведения раствора фермента с ингибитором.
По механизму действия выделяют конкурентное, неконкурентное, бесконкурентное, субстратное и аллостерическое ингибирование. [3]
Конкурентное ингибирование
Конкурентное ингибирование было открыто при изучении ингибирования, вызываемого аналогами субстрата. Это торможение ферментативной реакции, вызванное связыванием с активным центром фермента ингибитора сходного по структуре с субстратом и препятствующего образованию фермент-субстратного комплекса. При конкурентном торможении ингибитор и субстрат, будучи сходными по строению, конкурируют за активный центр фермента. С активным центром связывается то соединение молекул, которого больше.
Такие представления о механизме ингибирования были подтверждены экспериментами по кинетике реакций конкурентного ингибирования. Так, было показано, что в случае конкурентного ингибирования аналог субстрата не влияет на скорость разложения уже образовавшегося комплекса фермент–субстрат, т.е. при использовании «бесконечно большого» избытка субстрата получается одна и та же максимальная скорость как в присутствии, так и в отсутствие ингибитора. Напротив, ингибитор влияет на величину константы диссоциации и константы Михаэлиса. Из этого можно сделать вывод, что ингибитор реагирует с группами белка, участвующими тем или иным образом в связывании субстрата, следовательно, из-за взаимодействия его с этими группами прочность связывания субстрата уменьшается (т.е. уменьшается число молекул фермента, способных связывать субстрат).
Позже было показано, что кинетически конкурентное ингибирование может быть вызвано не только аналогами субстратов, но и другими реагентами, химическая структура которых абсолютно отличается от структуры субстрата. В этих случаях также предполагалось, что данный реагент взаимодействует с группой, ответственной за связывание субстрата.
Для конкурентного ингибирования теоретически могут существовать две возможности:

1. 
   связывающие и каталитические центры фермента перекрываются; ингибитор связывается с ними, но влияет только на группы центра связывания;
   
2. 
   центр связывания и каталитический центр в молекуле фермента пространственно обособлены; ингибитор взаимодействует с центром связывания.
   

Существуют следующие элементарные стадии реакции:

где I – ингибитор, а K_I – константа диссоциации комплекса фермент – ингибитор.

Относительная скорость (отношение скорости ферментативной реакции, измеренной в присутствии ингибитора (v_i), к максимальной скорости) равна

v_i / V = [ES] / [E]_T

поскольку для общей концентрации фермента справедливо

[E]_T = [E] + [ES] + [EI]

то 1 / v_i = (K_s / V[S]) (1 + [I] / K_I) + 1 / V

Очевидно, если [I] = K_I, то наклон прямой линии становится вдвое больше, чем для зависимости 1/v₀ от [S] (v₀ – скорость ферментативной реакции в отсутствие ингибитора).

Тип ингибирования обычно определяют графически. Конкурентное ингибирование легче всего распознается путем построения графиков Лайнуивера – Берка (т.е. графиков в координатах 1/v_i и 1/[S]) при разных концентрациях ингибитора. При истинном конкурентном ингибировании получается набор прямых, отличающихся тангенсом угла наклона и пересекающих ось ординат (ось 1/v_i) в одной точке. При любой концентрации ингибитора можно попользовать настолько высокую концентрацию субстрата, что активность фермента будет максимальной.
В качестве примера конкурентного ингибирования можно привести влияние различных веществ на активность сукцинатдегидрогеназы. Этот фермент входит в состав ферментной циклической системы – цикла Кребса. Его природным субстратом является сукцинат, а сходным с ним конкурентным ингибитором – оксалоацетат, промежуточный продукт того же цикла Кребса:

Аналогичным конкурентным ингибитором сукцинатдегидрогеназы является малоновая кислота, часто использующаяся в биохимических исследованиях.

На принципе конкурентного ингибирования основано действие многих фармакологических препаратов, ядохимикатов, используемых для уничтожения сельскохозяйственных вредителей, и боевых отравляющих веществ.
Например, группа антихолинэстеразных препаратов, к которым относятся производные четвертичных аммониевых оснований и фосфорорганические соединения, являются конкурентными ингибиторами фермента холинэстеразы по отношению к его субстрату ацетилхолину. Холинэстераза катализирует гидролиз ацетилхолина – медиатора холинэргических систем (нервно-мышечных синапсов, парасимпатической системы и т.д.). Антихолинэстеразные вещества конкурируют с ацетилхолином за активный центр фермента, связываются с ним и выключают каталитическую активность фермента. Такие препараты, как прозерин, физостигмин, севин, угнетают фермент обратимо, а фосфорорганические препараты типа армина, нибуфина, хлорофоса, зомана действуют необратимо, фосфорилируя каталитическую группу фермента. В результате их действия накапливается ацетилхолин в тех синапсах, где он является медиатором нервного возбуждения, т.е. происходит отравление организма накопившимся ацетилхолином. Действие обратимых ингибиторов постепенно проходит, так как чем больше накапливается ацетилхолина, тем быстрее он вытесняет ингибитор из активного центра холинэстеразы. Токсичность необратимых ингибиторов несравненно выше, поэтому их применяют для борьбы с вредителями сельского хозяйства, бытовыми насекомыми и грызунами (например, хлорофос) и как боевые отравляющие вещества (например, зарин, зоман и др.). [6]