Hujayra va gen ingenerligi

Transgen o`simliklarga genetik materiallarni ekspressiyasi
Olimlar o`simlik hujayrasiga begona genlarni kiritish bo`yicha olib borgan tadqiqotlarida yangi hodisalarga guvoh bo`lganlar. Aniqlanishicha, bir tajribaning o`zida bir xil DNK konstruktsiyasi bilan transformatsiyalangan transgen klonlar kiritilayotgan gen ekspressiyasi bo`yicha farqlanar ekan. Ekspressiya darajasi ko`pgina omillarga bog’liq bo`lib, u ayniqsa kiritilayotgan genning yadro xromatinini qaysi qismiga tushishiga bog’liq ekan. Bundan tashqari, yadro genomiga DNK konstruktsiyalangandа bir qancha o`zgarishlarga uchraydi (duplikatsiya, inversiya va b.) va bu ekspressiyaning pasayishigа olib keladi. Yana aniqlanishicha, qo`llanilayotgan transformatsiya protseduralari xo`jayin genomi uchun ham befarq emasdir.
Birinchidan, transgenni joylashishi qaysidir xo`jayin genini birlamchi strukturasini buzishi bilan birgalikda uni inaktivatsiyalaydi.
Ikkinchidan, o`simlik genomiga genlar agrobakterial yoki fizik o`tkazilganda turli ko`rinishdagi qaytа tuzilishlar, hatto xromosoma fragmentlarining translokatsiyasigacha kuzatiladi. Bularning barchasi o`simlik genomini normal faoliyat ko`rsatishini o`zgartiradi.
O`simlikka kerakli genni tutuvchi Ti-plazmida ketma-ketligini kiritishning 2 xil metodi yaratilgan:
1-metod-"oraliq vektorlar" metodi (kointegrativ vektorlar)-pBR 322 ichak tayoqchasidan foydalanishga asoslangan.
Ti-plazmidadan T-DNK restriktazalar yordamida kesiladi va E. soli da klonlash uchun pBR 322 plazmidasiga joylashtiriladi.T-DNK plazmidali bakteriyalar ko`paytiriladi va plazmida ajratib olinadi. So`ngra klonlangan T-DNKga restriktaza yordamida kerakli gen joylashtiriladi. Hosil bo’lgan T-DNKli rekombinant molekula yana bir bor katta miqdorda ko`paytiriladi, ya`ni ichak tayoqchasida klonlanadi. Shundan keyin kon`yugatsiya yordamida to`liq Ti-plazmidani tashuvchi agrobakteriya hujayrasigа kiritiladi. Nativ Ti-plazmidasining T-segmentlari va oraliq vektorlar o`rtasida gomologik rekombinatsiya ro`y beradi. Buning natijasida gen joylashtirilgan T-DNK normal DNK o`rniga nativ Ti-plazmidaga kiradi. T-segmentga kerakli genlar joylashgan Ti-plazmidani tashuvchi A.Tumefaciens hujayralari hosil bo`ladi. Ularning navbatdagi ko`chirilishi agrobakteriyalarga xos bo`lgan oddiy yo`l bilan amalga oshiriladi.
Ikkinchi metod binar (qo`sh) vektorlar sistemasini yaratishga asoslangan.
Oxirgi tadqiqotlardan ma`lum bo`lishicha, zararlash va transformatsiya uchun yaxlit Ti-plazmida kerak emas, balki T-DNK ning chekka uchastkasi va Ti -plazmidaning virulentlikka javobgar bir uchastkasining o`zi yetarlidir. Bu ikkala uchastka bir plazmidada bo`lishi ham shart emas. Agar agrobakteriyada bir segmentli Ti-plazmida va T-DNKli boshqa plazmida bo`lsa, bu bakteriyalar o`simlik hujayrasini transformatsiyalashi mumkin. Bunday holda istalgan gen joylashtirilgan T-DNK o`simlik genomi bilan integratsiyalanadi. Buning uchun bakteriya hujayralarida gomologik rekombinatsiya sodir bo`lishi kerak emas. Begona genlar ekspressiyasi uchun T-DNKning maxsus promotori, masalan nopalinsintetaza promotori kerakdir.
Konstruktsiyalangan shtammlarni o`simlikning zararlangan qismiga kiritishdir.
Boshqa metod-protoplastlarni agrobakteriyalar bilan kokultuvatsiyalash yo`li bilan transformatsiyalash. Agrobakteriyalar yangi ajratib olingan yoki bir kunlik protoplastlarga qo`shilsa, bakteriyalar birlashmaydi ham, transformatsiyalanmaydi ham. Transformatsiyalash uchun 3 kunlik protoplastlarda hujayra devori qaytadan hosil bo`lgan bo`lishi kerak. Bu hol hujayra devorini hosil qiluvchi va bakteriyalarni birlashtiruvchi ingibitorlarni qo`shish bilan isbotlangan. Kokultuvatsiyalash davri (bu davrda protoplastlar agrobakteriyalar bilan agregatsiyalanadi), ya`ni bir sutkadan ortiq vaqtdan so`ng birlashmagan bakteriyalar qayta yuvish bilan olib tashlanadi. So`ng o`simlik hujayralari gormonlar qo`shilgan muhitda o`stiriladi. 3-4 haftadan so`ng koloniyalar gormonsiz muhitga o`tkaziladi. Bu muhitda faqatgina transformatsiyalangan hujayralarning koloniyalari o`sadi.
Shunday usul bilan tamaki va petuninning transformatsiyalangan o`simlik-regenerantlari olingan.
Oxirgi 10 yil mobaynida tashqi bozorda yangi xususiyatlarga ega bo`lgan transgen o`simliklar chiqа boshladi. 1996-yili AQSHda transgen o`simliklar egallagan maydon 3 mln. akr bo`lsa, 2002-yilga bu maydon 80 mln akrga yetdi. Asosiy transgen o`simliklar: jo`xori, soya, gerbitsid va hasharotlarga chidamli g’o`zalardir.

O`simlik hujayrasiga konstruktsiyalangan Ti-plazmidani kiritishning bir nechta metodlari bor. Bulardan eng oddiyi tabiiy usul -