Hujayra va gen ingenerligi

Restriktaza-ligazali metod

DNK gibrid molekulasining in vitro olishning eng qulay oddiy metodi-restriktaza-ligazali metoddir. DNK ning gibrid molekulasini shu metod bilan 1973-yili S.Koen hamkasblari tomonidan olingan.
Ushbu metod 1.17 rasmda quyidagicha ifoda etilgan:
1.Restriktazalarning II sinfi DNK molekulasini yopishqoq uchlari o’zaro komplementar bo’lgan fragmentlarni kesadi.
2.Bir xil restriktaza bilan gidrolizlangan turli xil DNK molekulasining preparatlari ma’lum sharoitda aralashtirilganda turli xil DNK fragmentlarining yopishqoq uchlari o’zaro komplementar ta’sir hisobiga reassotsiyalanadi;
3.DNK – ligaza yordamida dNK fragmentlari kovalent bog’ hisobiga assotsirlanadi.
Bu sxema bilan DNK molekulasini bitta va o’sha restriktaza bilan gidrolizlangan ikki va har qanday fragmentlari in vitro kovalent birikishi mumkin. Restriktaza yordamida (ayniqsa bitta ferment bilan) o’rganilayotgan DNK ning spesifik, qa’tiy ma’lum nabordan fragmentlarini aniqlanadi. Bu metod restriktazali-ligazali metoddir. Hozirgi vaqtda modifikatsiya qilingan linkerli-molekula metodi keng qo’llanilmoqda. Bu metodda sintetik DNK ning segmentlari o’zining tarkibidagi ketma-ketlik restriktazalarni taniydi. Bu metodni 1977-yili R.Sheller va uning hamkasblari tomonidan taklif qilingan. Bu metod har qanday DNK fragmentlarini in vitro rekombinatsiyalshga imkon beradi.
Bu modifikatsiya qilingan metodda quyidagilar amlaga oshiriladi. Rasm 1.18
1.rekombinatsiyalanayotgan DNK fragmentining to’mtoq yoki yopishqoq uchlarini T₄fagning ligazasi bilan sintetik ikki zanjirli ma’lum restriktazani tanuvchi segmentlarini tikadi;
2.Olingan fragment tanlangan restriktaza ishlanadi, natijada yopishqoq oxirli uchlari hosil bo’ladi;
3.Olingan fragment-restriktaza-ligazali metod bilan DNK ning boshqa molekulasi bilan in vitro rekombinatsiyalanadi.
DNK fragmentlarini in vitro rekombinatsiyalashda linkerli molekulalarni qo’llash bilan restriktaza-ligazali metod universal bo’lib, dastlabki fragmentlarni turli usullar bilan olish mumkindir.
Restriktaza-ligazali metod konnektorli metod bilan solishtirganda, uning genetik injeneriyaga qo’llanish spektri keng bo’lib, DNK gibrid molekulasidan fragmentni oson ajratish mumkin, shuningdek fragmentlarni boshqa genetik muhitga o’tkazishda katta ahamiyatga ega.
Kombinatsiya qilinayotgan DNK molekulasi turli yopishqoq uchlariga ega bo’lib, ikkita restriktazalar bilan generatsiya qilinadi. Bunday holatda fragmentlar bir-biri bilan qa’tiy orientatsiyani saqlagan holda birikadi (rasm 2.5; 2.10). Bitta restriktaza bilan gidrolizlangandan keyin olingan fragmentlarni aralashtiriladi, turli orientatsiyali DNK molekulasining gibridlari hosil bo’ladi. Ligazali reaksiya jarayonida ikki va uch, undan ortiq fragmentlar birikishi mumkin. (rasm 1.18)
Maqsadli DNK fragmentlarini klonlashda amplifikasiya metodidan DNK segmentlarini polimer zanjirli reaksiyasidan foydalaniladi.
Ligazali reaksiya mahsulotlarining spektri ishtirok etayotgan DNK fragmentlarining konsentratsiyasiga bog’liq (rasm 1.19)
Yuqori konsentratsiyasida uzun ipsimon molekulasi hosil bo’ladi. Fragmentlarni konsentratsiyasining kamayishi bilan halqasimon DNK molekulasini hosil bo’lishi ortadi. Gibridli molekula ikki va uchdan ortiq fragmentlardan tashkil topadi. Agar preparat konsentratsiyasi kamaytirilsa, bunda gomohalqa hosil bo’ladi. Mana shunday metodlarni kombinatsiyalashgan holda qo’llshi natijasida DNK ni gibrid molekulasini olish mumkin.