Hisoblashning ochiq ramkasini izlash

Individual genlar gomologik rekombinatsiya orqali faolsizlantirilishi mumkin.

Muayyan genni inaktivatsiya qilishning eng oson yo'li uni DNKning aloqador bo'lmagan segmenti bilan buzishdir (7.13-rasm). Bunga genning xromosoma nusxasi va maqsadli gen bilan ba'zi bir ketma-ketlik identifikatoriga ega bo'lgan DNKning ikkinchi qismi o'rtasidagi homolog rekombinatsiya orqali erishish mumkin. Gomologik (va boshqa turdagi) rekombinatsiya murakkab hodisalar bo'lib, biz 14.3.1-bo'limda batafsil ko'rib chiqamiz. Hozirgi maqsadlar uchun ikkita DNK molekulasi o'xshash ketma-ketlikka ega bo'lsa, rekombinatsiya molekulalarning segmentlarini almashishiga olib kelishi mumkinligini bilish kifoya.

2.2.1-rasm. Individual genlar gomologik rekombinatsiyasi.

Gomologik rekombinatsiya orqali gen inaktivatsiyasi. Maqsadli genning xromosoma nusxasi klonlash vektori tomonidan olib boriladigan genning buzilgan versiyasi bilan rekombinatsiyalanadi. Natijada, maqsadli gen inaktiv bo'ladi. Rekombinatsiya haqida ko'proq ma'lumot olish uchun (batafsil.)

Amalda gen inaktivatsiyasi qanday amalga oshiriladi? Biz ikkita misolni ko'rib chiqamiz, birinchisi bilan S. cerevisiae. 1996 yilda genom ketma-ketligini tugatgandan so'ng, xamirturush molekulyar biologlari iloji boricha ko'proq etim genlarning funktsiyalarini aniqlash uchun muvofiqlashtirilgan, xalqaro harakatlarni boshladilar (Oliver, 1996b). Amaldagi texnikalardan biri 7.14-rasmda ko'rsatilgan (Wach va boshqalar., 1994). Markaziy komponent letion kassetasi’ bo'lib, u antibiotiklarga chidamlilik genini olib yuradi. Bu gen xamirturush genomining oddiy komponenti emas, lekin u achitqi xromosomasiga o'tkazilsa ishlaydi va antibiotik genetikiga chidamli o'zgartirilgan xamirturush hujayrasini keltirib chiqaradi. Yo'q qilish kassetasini ishlatishdan oldin, DNKning yangi segmentlari ikkala uchiga dum sifatida biriktiriladi. Ushbu segmentlar inaktivatsiya qilinadigan xamirturush genining qismlariga o'xshash ketma-ketlikka ega. O'zgartirilgan kasseta xamirturush hujayrasiga kiritilgandan so'ng, DNK dumlari va xamirturush genining xromosoma nusxasi o'rtasida homolog rekombinatsiya sodir bo'lib, ikkinchisini antibiotiklarga chidamli gen bilan almashtiradi. Shuning uchun almashtirishdan o'tgan hujayralar kulturani genetikasi bo'lgan agar muhitiga qo'yish orqali tanlanadi. Natijada paydo bo'lgan koloniyalarda maqsadli gen faolligi yo'q va ularning fenotiplari gen funktsiyasi haqida ma'lumot olish uchun tekshirilishi mumkin.
Gen inaktivatsiyasining ikkinchi misolida xamirturush emas, balki sichqonlar bilan o'xshash jarayon qo'llaniladi. Sichqoncha ko'pincha odamlar uchun namuna organizm sifatida ishlatiladi, chunki sichqon genomi inson genomiga o'xshash bo'lib, ko'plab bir xil genlarni o'z ichiga oladi. Shuning uchun noma'lum inson genlarining funktsiyalarini aniqlash asosan sichqonchadagi ekvivalent genlarni faolsizlantirish orqali amalga oshiriladi, bu tajribalar odamlar bilan axloqiy jihatdan aqlga sig'maydi. Jarayonning gomologik rekombinatsiya qismi xamirturush uchun tavsiflangani bilan bir xil bo'lib, yana bir bor maqsadli gen inaktiv qilingan hujayraga olib keladi. Muammo shundaki, biz faqat bitta mutatsiyaga uchragan hujayrani emas, biz butun mutant sichqonchani xohlaymiz, chunki faqat butun organizm bilan biz gen inaktivatsiyasining fenotipga ta'sirini to'liq baholashimiz mumkin. Bunga erishish uchun sichqonchaning maxsus turidan foydalanish kerak, an embrion poyasi yoki ES hujayra (Evans va boshqalar., 1997). Ko'pgina sichqon hujayralaridan farqli o'laroq, ES hujayralari totipotentdir, ya'ni ular yagona rivojlanish yo'liga sodiq emas va shuning uchun barcha turdagi differentsiatsiyalangan hujayralarni keltirib chiqarishi mumkin. Shunday qilib, ishlab chiqilgan ES xujayrasi sichqon embrioniga AOK qilinadi, u rivojlanishda davom etadi va oxir-oqibat sichqonchani, ya'ni sichqonchani mutant va mutant bo'lmaganlar aralashmasidan iborat bo'lgan ES hujayralaridan kelib chiqadi. embrionning boshqa barcha hujayralari. Bu hali biz xohlagan narsa emas, shuning uchun kimerik sichqonlarga bir-biri bilan juftlashishga ruxsat beriladi. Nasllarning ba'zilari ikkita mutant gametaning qo'shilishi natijasida hosil bo'ladi va shuning uchun ximerik bo'lmaydi, chunki ularning har bir hujayrasi faolsizlangan genni olib yuradi. Bular nokaut sichqonlari, va omad bilan ularning fenotiplari o'rganilayotgan genning funktsiyasi haqida kerakli ma'lumotlarni beradi. Bu ko'plab gen inaktivatsiyasi uchun yaxshi ishlaydi, ammo ba'zilari o'limga olib keladi va shuning uchun gomozigotli nokautli sichqonchani o'rganish mumkin emas. Buning o'rniga, sichqonchada o'rganilayotgan genning bitta to'g'ri nusxasi mavjud bo'lsa ham, gen inaktivatsiyasining fenotipik ta'siri aniq bo'ladi degan umidda bitta normal va bitta mutant gameta o'rtasidagi sintez mahsuloti bo'lgan geterozigota sichqoncha olinadi.