Fermentlarni immobillash va barqarorlash texnologiyasi. Reja

Polimerlanishda fermentning nofaol bo'lib qolishi

Polimer gelni hosil bo'lish jarayonida ferment denaturatsiya ta'sirlarga uchraydi va uning faolligi kamayishi hamda butunlay yo'qolishi mumkin.

Polimerlashda issiqlik ta'sir etishidan tashqari reaksion ara-lashmalar (birinchi navbatda monomerlar) ferment denaturatsiyasi-ni sodir qilishi mumkin. Masalan, akrilamid o'zining denaturatsiya qilish xususiyatiga ko'ra karbamidga yaqin tur ad i. Poliakrilamid esa bunday xususiyatga ega emas. Shuning uchun immobillashda polimer gelni har vaqt monomer va inisator qoldiqlaridan yuvish hisoblanadi.
Fermentlami faollanishi radikal polimerlanish jarayonida hosil bo'lgan erkin radikallar ta'siri ostida ham vujudga kelishi mumkin. Fermentni mana shunday ta'sirlardan saqlash uchun ba'zi hollar-da reaksion aralashmalarga barqaror holga keltiruvchi qo'shimcha moddalar qo'shiladi. Bunday qo'shimchalar jumlasiga, masalan, inert oqsillar (ko'pincha albumin) yoki shu ferment yordamida katalizga uchraydigan substrati moddani kiritish mumkin.
Anorganik geUar. Fermentlami immobillash uchun polikrem-niy kislotasining geli (silikagel)ni ishlatish mumkin. Immobillash usuli shundan iboratki, silikagelga (yoki biror kremniy organik birikmaning gidrolizi natijasida hosil bo'lgan gelga) ferment erit­masi qo'shiladi. Bir necha soatdan keyin o'z-o'zidan polimerla­nish hisobiga kremniy atomlaridan tashkil topgan kislorod bog'lari bilan bog'langan uchlamchi to'rdan iborat gel hosil bo'ladi. Olin­gan gel quritiladi, maydalanadi va bog'lanmagan fermentdan uzib tashlanadi.
Ba'zida fermentlami immobillash uchun kalsiy fosfat geli ish­latiladi. Bunday hollarda fazoviy to'rni hosil bo'lishi koveleni bog'larga emas, ion bog'lar tufayli vujudga keladi.
Tikilmagan polimer geUar. Immobillashda tabiiy polimer (polisaxarid)larning xususiyatlariga bog'liq, ular jumlasiga, krax­mal, agar-agar, karraginan va agarozalami kiritish mumkin. Bu moddalaming issiq suvli eritmalari sovutilganida gellar hosil bo'ladi. Buning uchun tayyorlash polisaxaridning suvli suspen­ziyasi (aralashmasi)ni obdon erib ketishi uchun 80-90 °C gacha qizdiriladi va hosil bo'lgan eritma asta-sekin sovitiladi.
Gel hosil bo'lishi boshlanishidan oldin (ko'pincha 30 °C va 50 °C orasida) tizimga fermentning suvdagi eritmasi qo'shiladi. Gelning keyingi sovitilishi natijasida immobillangan ferment hosil bo'ladi.
Fermentlami immobillash uchun tabiiy polimer kollagen keng ko'lamda ishlatiladi. Kollagen yordamida fermentlami immobil-lashning, asosan, uch xil usuli mavjud: makromolekular kom-pleks hosil qilish, bevosita va elektr yordamida cho'ktirish. Mak­romolekular kompleks hosil qilishda kollagen pH ko'rsatkichli kichik (2-4,5) yoki yuqori (8,5-12) bo'lgan suvli eritmalarda maydalanadi va ferment qo'shib aralashmani 12-20 soat davomi­da saqlanadi. Hosil bo'lgan aralashmani yupqa qavat qilib inert plastinkaga qo'yib quritiladi.
Natijada fibrill kollagenidan to'qilgan uchlamchi devor tuzi-lishiga ega bo'lgan, o'zida ferment tutgan oqsil membranasi vujud-ga keladi. Makromolekular kompleks hosil qilish usuli kislotali va ishqoriy muhitga chidamsiz, shuning uchun fermentlami immo-billashga yaramaydi, chunki bu usul fermentni uzoq vaqt ma'lum pH ko'rsatkichli ekstremal muhitda saqlashni talab etadi. Immo­billash bevosita olib borilsa, bu qiyinchilikni chetlab o'tish mum­kin, buning uchun ferment eritmasi tayyor kollagen membranaga singdiriladi.
Elektr yordamida cho'ktirish usuli bilan immobillashda dispers kollagen aralashmasi va ferment eritmasi elektrodlar orasiga joy-lanadi hamda tok ulanadi. Elektr maydon ta'siri ostida ferment va kollagen molekulalari elektrodlarning biri tomoni bo'ylab (eritma-ning pH iga bog'liq holda) harakatlana boshlaydi va uning yuzasi-da membranaga cho'kadi. Bu usul shunisi bilan qulayki, u jara-yonning umumiy yuqori tezligida istalgan qalinlik va konfigura­tsiyadagi membrana olishga imkon beradi. Bu vaziyat juda muhim hisoblanadi, chunki pHning noqulay ko'rsatkichlari ta'siri ostida fermentning faolsizlanishga uchrash ehtimoli kamayadi.
Kovalent chok kiritilishi bilan polimer asoslari (matritsasi)ning mexanik mustahkamligini oshirishga va kiritilgan fermentning qat-tiqroq ushlanib qolishiga yordam beradi. Polimer zanjirlar o'rtasida chok hosil bo'lishiga erishish mumkin. Masalan, polisaxarid gellar ham tikuvchi bifunksional reagentlar bilan tikilishi mumkin.
Darhaqiqat, kollagen membranalarni qo'llash uchun glutar aldegidi ishlatiladi.
Fermentlarning tikilgan oqsil matritsasiga kiritish usuli ham mavjud, bunda fibrinogenni qo'llashga asoslagan. Immobillash­ning bunday usulida fibrinogen va fermentning bufer eritmasiga trombin oqsili qo'shiladi. Buning ta'siri ostida fibrinogen uchlam-chi to'r hosil qiluvchi fibringa - ya'ni, polimer oqsilga aylana-di. Uning bahosi juda yuqori. Lekin u zaharlilik va antigenlik-dan mustasno bo'lganligi uchun tibbiyotda qo'llash katta qiziqish uyg'otmoqda.
Gelning polimer zanjirlari orasida elektrostatik o'zaro ta'sir hisobiga mustahkam bog' hosil qilishga erishish mumkin. Poliva-lent kationlar ishtirokida polielektrolitlaming gel hosil qilishi sinte­tik polielektrolitlaming malein angidridi sopolimerini va vinil spir-tining metilini qo'llashga asoslangan.
1980-yilda polielektrolit komplekslari yordamida asos immobillashda musbat zaryad N-alkillangan polivinilpiperidin-ga kovalent tikish yo'li bilan fermentni modifikatsiya qilinadi va manfiy zaryad tutgan polimetakril kislotasining suvdagi erit­masiga solinadi.
Muhitdagi pH va ion kuchiga bog'liq holda qarama-qarshi zar­yadlangan polielektrolitlar bo'lmagan eritmada mavjud bo'ladi yoki fermentni cho'kmaga cho'ktirgan, erimaydigan mustahkam kompleks hosil qiladi.
Gomogen eritmada kechadigan fermentativ reaksiya rugagan-dan keyin, ion kuchi yoki pH ni o'zgartirish yo'li bilan ferment cho'kmaga tushiriladi. So'ngra cho'kma eritmaga solinadi va butun jarayon boshidan qaytariladi.
Immobillash uchun tikilgan geUar boshqa sintetik polimer­lar asosida ham olinishi mumkin. Masalan, polivinil spirt hamda polivinil pirrolidonga nurlar yog'dirish yoki polimer zanjirga elek-tronlar oqimi ta'sir ettirish natijasida erkin radikallar hosil bo'ladi, so'ngra ularning bir-biriga ta'sir etishi natijasida zanjirlar orasida kovalent bog' (chok) hosil bo'ladi.
Immobillash uchun tikilgan polimer matritsani kremniy orga-nik polimer polimetil siloksan asosida ham olish mumkin. Qat­tiq gel hosil bo'lishi uchun polimer va fermentdan iborat tizim-ga vulkanizatsiya qilinadigan modda kiritish kerak bo'ladi, bu o'rinda ikki valentli qalay oktanoati ishlatiladi.
Keyingi vaqtlarda smolalardan tuzilgan polimerni matritsaga fermentni fotopolimerlash yo'li bilan kiritib ularni immobillash usuli keng qo'llanilmoqda. Ular fotosezgir funksional guruhi tut-gan oligomerlardan yoki polimerlardan (makromonomerlardan) tashkil topgan bo'ladi. Immobillashni o'tkazish vaqtida smola, fer­ment va initsiator tutgan eritmani bir necha daqiqa davomida ultra-binafsha nur bilan yoritadi.
Nut ta'siri natijasida faollangan fotosezgir guruhlar o'zaro kovalent bog' hosil qiladi, buning natijasida ferment molekulalari kiritilgan, tikilgan uchlamchi polimer to'r hosil bo'ladi. Immobil-lashning bu usuli shunday afzallikka egaki, bunda hosil qilingan polimer gellarning xossalari kerakli makromonomer tanlash orqa-li maqsadga erishadi.
Gelda immobillangan ferment preparatining katalitik faolligi kiritilgan ferment miqdorining oshishi bilan o'sadi. Dastlabki gelni tayyorlash uchun ishlatiladigan aralashmadagi ferment konsen­tratsiyasini oshirish bilan ham bunday samaraga erishish mumkin. Lekin shu narsani ko'zda tutish kerakki, hosil bo'ladigan tizimlarda oqsillaming gelda eruvchanligi bufer eritmadagi eruvchanligiga nisbatan ancha kam bo'lishi mumkin.
Geldagi tesmWarning diametri qanchalik kichik bo'lsa. gel matritsasida ferment shuncha mustahkam bog'lanadi. Binobarin, immobillangan ferment preparatining katalitik faolligi ham katta bo'ladi.
Dastlabki aralashma tarkibini o'zgartirish bilan gelning go-vakligini o'zgartirish mumkin. Masalan, akril kislotaning hosila-sini polimerlash bilan olingan gellarning zichligi monomerining dastlabki konsentratsiyasi oshishi bilan ortadi. Shuni unutmas-lik kerakki, monomeming juda yuqori konsentratsiyasi ferment­larni denaturatsiyaga uchratishi mumkin. Aslida monomeming 30-60 % ligi maqsadga muvofiq keladi. Teshiklar kattaligi mono­mer eritmasiga qo'shilayotgan tikuvchi agent konsentratsiyasiga ham bog'liq.
Akril polimerlarda esa buning tikuvchi taxminan 5 % kon-sentratsiyasida tizimga kiritilgan ferment faolligi maksimumga erishadi.
Fermentlarning immobillanishida gel g'ovaklarining diametrini oshirishdagina emas, balki ferment globulasi o'lchamining kattali-giga ham bog'liq bo'ladi. Shuning uchun immobillash vaqtida fer­mentlarni yuvilib ketishining oldini olish uchun ba'zida immobil-lashdan awal fermentni glutar aldegid bilan ishlanadi. Buning nati­jasida polimerli matritsada mustahkam bog'lanib qoluvchi kova­lent tikilgan katta oqsil hosil bo'ladi.