Fermentlarni immobillash va barqarorlash texnologiyasi. Reja

Ikkinchisi, fermentlarning kimyoviy modifikatsiyasida ular­ning xossalari (substratga spetsifildigi, katalitik faolligi, stabilligi) o'zgaradi, ya'ni fermentlar barqarorlashadi.
Immobillash uchun cheklanmagan materiallar (shisha, sopol, metall oksidlari va boshqalar) tabiiy polimerlar (selluloza, xitin, agaroza, kraxmal va boshqa polisaxaridlar) va albatta, sintezlangan polimer va sopolimerlar mavjud.
Shunday qilib, fermentlarning kovalent immobillash deganda, kimyoviy bog'lar orqali bir-biri bilan o'zaro bog'langan uchta ele-mentning tuzilishi tushuniladi: T-S-F (maksimum holat) yoki ikki­ta T-F va S-F (minimum holat).
Bu konstruksiyani mukammal ravishda ko'rib chiqamiz. Tashuvchining yuzasida funksional guruhlar bor, ular fermentlar­ning funksional guruhlari bilan kovalent bog'lanadi. Natijada, kimyoviy reaksiyaga kirisha oluvchi immobillangan ferment hosil bo'ladi.
Demak. ferment eritmasiga tashuvchi kiritilib, qaytmas adsorbsiya sodir bo'lib. ferment va tashuvchi o'zaro bir yoki bir ncchta kovalent bog Чат orqali tikilib qoladi. Oqsilni tashuvchi bilan juda yaqin masofada bo'lishi maqsadga muvoriq emas, chunki ferment mikromuhitining noqulay o'zgarishiga, sferik (fazoviy) va diffuzion cheklanishlarni bisobga olishga sabab bo'ladi. Bunday vaziyatdan chiqishning yagona yo'li immobil­langan ferment molekulasini tashuvchi yuzasidan ma'lum maso-faga surish hisoblanadi. Buning uchun har xil uzunlikdagi tikuv-chi reagentlar ishlatiladi.
Ular oddiy bifunksional (ya'ni, kimyoviy tabiatiga ko'ra ikki-ta bir xil yoki har xil reaksiyaga kirishishga qodir gumhlar) va o'ta murakkab polifunksional bo'lishi mumkin, bir-biridan farq qiladi-gan zanjirlaming kimyoviy tabiati ular orasidagi bog'laming har xil mustahkamligiga bog'liq. Kovalent immobillashning umumiy negizi sifatida ishlatiladigan tikuvchi agent yordamida ferment tashuvchi bilan bog'lanadi.
Buusulningafzalligi:

1. 
   tikuvchi agentning uzunligini (yoki har xil uzunlikdagi tikuvchi agentlarni optimal aralashmasini) tanlash bilan immo­billangan fermentning katalitik xarakteristikalarini o'zgartirish mumkin;
   
2. 
   chokni shunday konstruksiyalash mumkinki, bunda ma'lum bir sharoitlarda yoki ma'lum reagentlar bilan spetsifik holda par-chalanadigan (chunonchi ferment yordamida) o'zgaruvchi bog' saqlanishi kerak, bu bog' immobillangan fermentni tashuvchidan ajratishda (masalan, tirik organizmda yo'naltirilgan fermentlar transporti muammosini hal qilishda) nazorat kaliti hisoblanadi.
   

Fermentlarni kovalent immobillashda ferment molekulaJari-ning har xil turda kovalent tikilish xususiyati ahamiyatga ega-dir. Ferment turlarini yaratish fikri (fermentlar retikulatsiyasi) fer­ment molekulasining polifunksional tabiatidan kelib chiqadi, uning yuzasida faol markazdan tashqari ko'p miqdorda reaksiyaga kiri­shishga qodir guruhlar mavjud.
Ferment eritmasiga bifunksional tikuvchi agent kiritilganda fermentning ayrim molekulalari bir-biri bilan tiqilib, murakkab-roq yoki murakkabmas to'rsimon tuzulishga ega bo'lgan agregat-lar hosil qiladi. Tikuvchi agentning tabiati va miqdoriga qarab. suvda eriydigan va suvda erimaydigan preparatlar hosil bo'lishi mumkin.
Immobillashda oldindan qo'sh bog'li reagent (masalan, akri-loilxlorid) bilan kovalent modifikatsiyalangan fermentlarning qo'llash mumkin. Bu holda oqsil makromonomerining past mole-kular monomerlar (masalan, akrilamid) bilan sopolimerlanganida oqsil yoki qo'shimcha tikuvchi monomerlar (masalan, N, N-metil - bis-akrilamid) bilan tikilgan to'rsimon gellar hosil bo'ladi.
Ko'rib chiqilayotgan tizimda dastlabki holat - suyuq-eritmadan oxirgi (polimerlanishdan keyin) holat - qattiq jism (gel)dan iborat bo'lib, hosil bo'lgan mahsulot polimerlanish uchun qo'llanadigan idish shaklini oladi.
Erituvchi hajmida oqsilni tikish (polimerlash) bilan uch o'l-chamga ega bo'lgan yirik gel olinadi. So'ngra uni maydalab sus-penziya ko'rinishda ishlatish mumkin. Uch o'lchamga ega bo'l­gan gellarni to'g'ridan-to'g'ri emulsion polimerlash yo'li bilan olish mumkin. Organik erituvchilarda SFMga aylangan mitsellalar tizimi qo'llansa, fermentning ayrim molekulalarini kerakli qalin-likdagi qobiq bilan tikish mumkin.
Fizikaviy adsorbsiya yo'li bilan kimyoviy inert tashuvchiga oldindan immobillangan fermentni tikuvchi agent bilan ta'sirlashi-shi natijasida, preparatlarning mustahkamligi (qattiqligi) oshadi.
Har qanday ferment asosini bir yoki bir necha polipeptid zan-jirining zich.konstruksiyasidan tuzilgan, disulfid ko'priklar bilan kovalent tikilgan (bog'langan) oqsil tashkil etadi. Masalan, anor-ganik va organik tabiatga ega bo'lgan prostetik guruhlarda (lipo-proteinlarda) va uglevodlardagi (glikoproteinlardagi) ba'zi fer­mentlar tarkibida oqsildan tashqari komponentlar ham uchraydi.
Umuman, immobillashning kimyoviy usullari ferment moleku-lasining oqsil qismida modifikatsiya qilish jarayonini tanlashda uning molekula tuzilishidagi o'ziga xoslikni e'tiborga olish kerak.
Yumshoq sharoitda natriy periodat bilan oksidlash orqali fer­mentning polisaxarid qismiga aldegid guruhlari kiritiladi, keyingi bosqichda esa ular ko'magida aminoguruhlar tutgan tashuvchilar (yoki tikuvchi agentlar) bilan kimyoviy o'zaro ta'sir amalga osha-di (bunda Shiff asoslari vujudga keladi).
Fermentlarning oqsil qismlari o'zaro peptid bog'i bilan bog'-langan 20 ta aminokislotadan tashkil topgan. Oqsillarning poli-peptid zanjirlarida qoldiq aminokislotalar miqdori bir necha o'ndan to minggacha bo'ladi, ammo oqsillarning sifat tarkibi (u yoki bu aminokislota qoldig'ining borligi) juda o'xshash.
Oqsildagi barcha aminokislotalarning taxminan yarmi qutblan-magan yoki kam qutblangan ion tashkil etadi, natijada polipeptid zanjirlar globular strukturaga aylanadi, ularning yadrolari polipep­tid zanjiming qutblanmagan bo'laklarini tashkil etadi, tashqi qavat esa qutblangan va ionogen guruhlarni hosil qiladi.
Tashqi qavatga -SH, -OH, -COOH, -NH₂ lar kiradi. Shubha-siz, gidrofob guruhlarning ba'zilari ham sirtga joylashgan bo'lishi mumkin, ular globulada substratlarni bog'Iovchi sohalarni tashkil qiladi.
Aromatik aminokislotalar (tirozin va triptofan) qoldiqlari ichki soha bilan tashqi qavat orasiga joylashadi, ularning bir qismi erit-maga o'tadi. Binobarin, oqsil molekulalaming tashqi qismini funk-sional guruhlar bilan qurshalgan o'ziga xos pufaklar ko'rinishda tasawur qilish mumkin, bular jumlasiga tiolli (sistein), gidroksilli (alifatik - serin va treonin, aromatik - tirozin), karboksilli (glutamin va asparagin kislotalari hamda -C- bilan tugallangan) guanidin-li (organik), imidazolli (gistidin) va aminoguruhlar (lizin va N -bilan tugallangan) funksional guruhlar kiradi. Oqsillarda u yoki bu guruhlar miqdori turlicha bo'ladi. Masalan, molekular og' irligi tax-

minan 25000 bo'lgan tripsin yoki ximotripsin kabi u qadar katta bo'lmagan oqsilda 10 ta sistein qoldig'i, taxminan 30 ta alifatik OH -guruhlar, 3-7 tirozin qoldig'i. 7-12 arginin qoldig'i, lOdanortiq aminoguruhi va 40 ga yaqin karboksil guruhi qoldiqlari bo'lishi kerak.
Ma'lumki, istisnosiz qoida bo4maydi. Tabiatda shunday oqsil­lar mavjudki, ularda yuqorida bayon etilgan aminokislota qoldiqlari bo'lmasligi mumkin. Molekular og'irligi 35000 bo'lgan proteolitik ferment pepsinda ikkita aminoguruhi bor: biri - lizin va ikkinchisi NH₂ - bilan tugallangan aminokislotalardir; lekin oqsil molekula-sining yuzasidagi bu kamchilik boshqa qismlar bilan to'ldiriladi.
Umuman olganda, oqsildagi funksional guruhlaming soni modifikatsiya qiluvchi reagentlar uchun yetarli darajada bo'ladi, oqsil molekulasini kovalent immobillashda bu holat yechilmay-digan muammo bo'la olmaydi. Lekin bu borada juda ko'p boshqa muammolar bor.
Chunonchi, kovalent immobillash jarayonida oqsil molekula-sining shunday guruhlari qatnashishi kerakki, bunda uning funk-siyasiga (bu holatda katalizga) salbiy ta'siri bo'lmasligi lozim. Shu jihatdan kovalent immobillash uchun oqsildagi qaysi funksional guruhlar zarurligini aniqlash kerak.
Buning uchun quyidagi shartlar asos qilib olinadi. Birinchidan, bunday funksional guruhlar - yuqori darajada reaksiyaga kirishish xususiyatiga ega boiishi. modifikatsiya reaksiyasini oqsil denatu-ratsiyasiga uchramaydigan yumshoq sharoitlarda olib borish kerak bo'ladi. Ikkinchidan. oqsilda bunday guruhlaming yetarli miqdor­da mavjud bo'lishi, ular yangi kimyoviy bog'larni kiritish uchun qulayliknita'minlashi kerak.
Oqsilda reaksiyaga kirishish xususiyati eng kuchli funksional guruhi - sisteinning SH - guruhidir. Ular har qanday (oksidlanish. atsillash, alkilianish va boshqa) kimyoviy reaksiyalarda ishtirok eta oladi. Ammo oqsilning о zidagi tiol -uruhlar kovalent immobillash uchun yetarli darajada qulay nishon bo'la olmaydi. Buning asosiy sababi shundaki, oqsilda umuman sistein каш bo'ladi. Juda ko'p oqsillarda erkin SH - guruhlar umuman bo'lmaydi.
Ular ferment strukturasini stabillaydigan disulfid ko'priklar hosil qilishda ishtirok etadi. Ba'zi oqsillarda shunday guruhlar bo'lsa, ular oqsilning katalitik faolligini oshirish uchun xizmat qila­di, bunda immobillash vaqtida SH - guruhini himoya qilish zaru-riyati tug'iladi.
Bunga har xil yondoshishlar bilan erishish mumkin. Masalan, oqsil p-oksimerkuribenzoat bilan ishlanadi, immobillash tugagan-dan so'ng himoyachi guruhi kuchsiz kislotali muhitga o'tib ketadi. Ta'kidlangan qiyinchiliklarga qaramasdan, ferment molekulalari-dagi SH -guruhini kovalent immobillash uchun qo'llash e'tiborga loyiqdir. Oqsil molekulasiga ekzogen SH - guruhlami kiritish usul­lari ishlab chiqilgan (muvofiq reagentlar, masalan, gomosistein-ni tiolakton bilan atsetillash orqali aminoguruhlarining modifika­tsiyalash usullari yaratilgan).
Oqsildagi aminoguruhlarni kimyoviy modifikatsiyalash va fer­mentlarni kovalent immobillash maqsadida ishlatiladi. Bu bir qator sabablarga asoslangan.