Farmatsevtik biotexnologiya

T-DNK vektor vazifasini bajarishi mumkin
T-DNK o'simlik genomiga begona genlarni kiritish uchun ideal vektor bo'la oladi. 
Sababi T-DNKda 2ta ajoyib hususiyat bor: 

agrobakteriya ikki pallali o'simliklarni deyarli barchasini transformatsiyalaydi (hattoki 
boshoqli ekinlarni ham); 

T-DNK o'simlik genomiga joylashib oladi. Oqibatda T-DNK genlari o'simlikning 
keyingi avlodlariga dominant belgi sifatida Mendel' qonunlari bo'yicha irsiylanaveradi. 
Transgen o'simlik yaratish uchun Ti-plazmidaning T-DNK qismiga kerakli genlar kiritilsa 
bas, qolgan barcha ishni bakteriyani o'zi bajaradi. Biroq recombinant DNK olish uchun Ti-
plazmidaning o'lchami juda katta. Ushbu muammoni hal qilish maqsadida quyidagi rasmda 
ko'rsatilgan tehnologiya ishlab chiqilgan.
15-rasm. Ti-plazmidadan vektor sifatida foydalanish. Dastlab Ti-plazmidadan restriktazalar 
yordamida T-DNK kesib olinadi. Kesib olingan T-DNK 
E. coli bakteriyasining 
pBR322 
plazmidasiga kiritiladi. pBR322 plazmidasidagi T-DNKga o'simlik geni joylashtiriladi. Gibrid 
plazmida hosil bo'ladi. Bu plazmida agrobakteriyaga qayta kiritiladi. Agrobakteriya esa 
o'simlikka yuboriladi.
Dastlab Ti-plazmidaning T-segmenti restriktazalar bilan kesiladi. T-segmentni ko'paytirish 
uchun 
Escherichia 
coli 
bakteriyasinng
pBR322 
plazmidasiga 
kiritiladi. 
pBR322 
replikatsiyalanganda undagi T-segmentni soni ham ko'payadi. Bu jarayon 
klonlash 
deyiladi. 
Tarkibida T-segment saqlagan pBR322 plazmidasi etarlicha klonlangandan keyin bakteriyadan 
ajratiladi. Ajratilgan gibrid plazmidaga o'simlik geni joylashtiriladi va yana klonlash uchun 
Escherichia coli
bakteriyasiga qayta kiritiladi. Klonlangan plazmidalar 
Escherichia coli
bakteriyasidan ajratiladi va 
agrobakteriya sitoplazmasiga kiritiladi. So'ngra agrobakteriya 
o'simlikka yuboriladi. Agrobakteriyadagi gibrid plazmidaning T-segmenti o'simlik genomiga 
qo'shilib ketadi. Transgen o'simlik ana shunday tehnologiya asosida yaratiladi.
Yuqorida keltirilgan tehnologiyani biroz soddalashtirish mumkin. Buning uchun binar 
vektor 
sistemalardan 
foydalaniladi. 
Bunda 
agrobakteriya 
hujayrasida 
ikki 
hil 
modifikatsiyalangan Ti-plazmida bo'lishi kerak. Plazmidalarning biridafaqat vir-zona bo'ladi. 
vir-zona T-DNK kesilishi uchun javobgar. Bunday plazmidalar yordamchi plazmidalar deyiladi.

---

34 
Ikkinchi plazmidada esa faqat o'simlik geni kiritilgan T-DNK bo'ladi. 
Ikkala plazmida bitta hujayraga joylashtiriladi. Agrobakteriya ikki hil plazmidasi bilan 
birga o'simlikka yuboriladi. Yordamchi plazmidaning vir-zonasi ikkinchi plazmidaning T-
segmentini kesadi. Yuqorida ta'kidlanganidek, T-segment o'simlik genomiga birikadi.
Qisqa qilib aytganda, Ti-plazmida asosidagi ideal vektor sistema quyidagi elementlar va 
hossalarga ega bo'lishi zarur:
1)
o'simlik genomiga barqaror qo'shilishi uchun barcha kerakli signallar, 
genlarning ekpressiya sistemasi (o'simlik polimerazalari «taniydigan» promotor), 
transformatsiyalangan hujayralarni selektsiyasi (saralash) uchun marker;
2)
vektor sistemada onkogenlar bo'lmasligi kerak. Ular o'simlik hujayralarini 
differentsiyallanishini to'htadi.
Onkogenlarni yo'qotish uchun 
transpozonli mutagenez
(transpozon - ko'chib yuruvchi genetik 
element) usuli qo'llaniladi. T-DNKga transpozonlar kiritilsa, 
o'simlikda
shish hosil qiladigan 
genlar (
iaaM, iaaH, ipt
) «o'chiriladi». Transpozonlar T-DNKni o'simlikka o'tishiga halaqit 
qilmaydi. Transpozonli mutagenezda Tn5, Tn7 bakterial transpozonlardan foydalaniladi. 
Ti-plazmidani 
modifikatsiyalashda 
restriktsiya 
saytlariga 
(restriktazalar 
kesadigan 
uchastkalar) ham e'tibor berish kerak. Modifikatsiyada EcoR1, Hind III, BamH1 va boshqa 
restriktazalar ishlatiladi. Ba'zida ma'lum bir saytning 18-20uchastkasidan taniydigan turli hil 
restriktazalar bo'ladi. Shuning uchun bunday uchastkalar 
polilinkerlar
deb ataladi.
Bundan tashqari, vektor molekulalarini konstruktsiyalashda promotorlarga ham e'tibor berish 
kerak. Promotor quyidagi hossalarga ega bo'lishi kerak: 

faol ekspressiya; 

to'qima va organspetsifik ekspressiya; 

boshqarilish imkoniyati. 
Ayrim genlar yuqori temperatura ta'sirida faollanadi. Bunday genlar boshqariladigan 
promotorlarga misol bo'ladi. Ayrim genlar zahira oqsillari (masalan, boshoqli o'simliklarda 
uchraydigan zein oqsili) sintezini nazorat qiladi. Ular to'qima spetsifik ekspressiyaga misol 
bo'ladi. 
O'simliklar gen muhandisligida ko'p ishlatiladigan promotor - CAMV (
cauliflower mosaic 
virus
– gulkaram mozaikasi virusi) promotori. CAMV promotoriga ulangan genlar o'simlikning 
barcha to'qimalarida faol ekpressiyalanadi.
Va nihoyat vektorlarda markerlar ham bo'lishi zarur. Chunki transgen o'simliklar marker 
genlar yordamida saralanadi. Marker genlar reporter genlar ham deyiladi. Marker genlar soni 
anchagina. Misol uchun, 
luxA va luxB genlari. Ular tunda yonib turadigan hasharotlar 
DNKsidan ajratilgan. luxA va luxB genlari lyutsiferaza fermenti sintezini boshqaradi. 
Lyutsiferaza oksidlangan lyutsefirin pigmentini lyutsefiringa o'tish reaktsiyasini katalizlaydi. 
Tungi hasharotlarning yonib turishiga luytsefirin pigmenti sababchidir. luxA va luxB marker 
genlarini saqlagan transgen o'simlikni boshqalaridan ajratib olish oson. Chunki ular, yuqorda 
aytganimizdek, chiroq shu'lasi kabi yonib turadi.
Ohirgi paytlarda pgfp markeri ham keng ishlatilmoqda. Bu gen
GFP-oqsili (green fluorescent 
protein) sintezini nazorat qiladi.
 U Acquorea victoriameduzasining DNKsidan olingan. Tanasida 
pgfp markeri saqlagan transgen o'simlikka ul'trabinafsha nur tushurilsa, u yashil rang berib 
tovlanadi.
T-DNK orqali o'simlik hujayralarini transformatsiyalashning an'anaviy usuli - mahsus 
jarohatlangan yosh o'simlik novdasiga tarkibida
Ti-plazmida mavjud agrobakteriyani 
kiritish.
Hozirda transgen o'simlik olishning bir necha hil usullari ishlab chiqilgan. Hattoki mahsus
«Shotgun» qurilmasi yaratilgan. DNK molekulalari vol'fram sharchalar bilan o'raladi va 
«Shotgun» qurilmasida o'simlik tanasiga miltiqdan o'q otish kabi otiladi.