3-ma’ruza Mikrobiologiya tadqiqotlarining asosiy usullari

Fiksirlangan bo’yalgan preparat tayyorlash
Preparatni mikroskopda ko’rish. Mikroskopni talaba o’ziga nisbatan perpendikulyar holda qo’yadi,. Ko’zgudan va kondensorning iris diafragmasidan foydalanib, kunduzgi yorug’likda yoki maxsus yoritgichlar, masalan, OI-19 dan foydalanib yorug’lik topiladi. Preparatga bir tomchi immersiya moyi tomiziladi va mikroskopning buyum stolchasiga joylashtiriladi. Mikroskop revolveridagi 90x ob’ektiv (immersiya ob’ektivi) preparatni ko’rishga moslanadi, yon tomondan kuzatilgan holda ob’ektiv linzasi moyga botiriladi. Okulyarga qaragan holda makromurvat yordamida ob’ekt topiladi. Aniq ko’rinishga erishish uchun mikromurvatdan foydalaniladi. Mikromurvatdan juda ehtiyotlik bilan foydalaniladi - soat mili yo’nalishida yoki aksincha, faqat 1 - 2,5 aylanishdan ortiq buralmaydi. Preparatni yoritilishini kondensorni vertikal yo’nalishda harakatga keltirib, kamaytiriladi yoki ko’paytiriladi. Bo’yalgan preparatlarni kuzatganda kondensor taqalguncha yuqoriga ko’tariladi.
Mikrobiologiyadan amaliy mashg’ulotlar uchun tutilgan maxsus alьbomga ko’rish maydoniga o’hshash, 3-4sm lik doira chiziladi. Unga o’rganilayotgan bakteriya hujayralarining rasmi chiziladi, o’lchamlari va shakllariga alohida ahamiyat beriladi, kerakli yozuvlar yoziladi.
Ish tugagandan so’ng ob’ektivdagi moy tozalanadi, (toluol shimdirilgan paxta bilan artiladi) revolьverdagi kichik ob’ektiv fiksirlanadi, tubus va kondensor tushiriladi hamda mikroskop va boshqa o’quv qurollari maxsus joyga ko’yiladi, ish joyi tartibga keltiriladi.
Mikroorganizmlar uchun oziq muhiti. Mikrobiologiya fani rivojlangan sari mikroorganizmlarni o’stirish metodlar ham takomillashib bormoqda. Lui Paster davriga qadar mikroorganizmlar uchun oziq muhiti sifatida qaynatilgan oziqlardan foydalanib kelingan bo’lsa, Lui Paster va K. Negeli oqsilsiz oziq muhitini qo’llashni tavsiya etadi.
Robert Kox va F. Lyoffler kaynatma sho’rva, peptok va oga tuzidan foydalanishni tavsiya etadilar. Bunday oziq muhiti go’shtpeptonli sho’rva bulib, unga 1—2% quruq agaragar qo’shiladi. Agaragar (jele) murakkab organik modda bo’lib, suvo’tlardan olinadi. Tarkibida 70—75% G’e, 11—22% H2O, 2—4% kul, 0,4— 0,9% umumiy azot, 0,03—0,09% ammiakli azot uchraydi. AgaragaRNing asosini kaltsiy tuzlari, nordon efirlar, sulfat kislota va uglevod kompleksipolisaxaridlar (arabinoza, glukoza, galaktoza va boshqalar) tashkil etadi.
Agaragar 80—86°da eriydi, 36—40° da qotadi. SHu xususiyati tufayli mikrobiologiyada keng foydalaniladi. Oziq muhitini 3 grupiaga bo’lish mumkin:
1) oddiy yoki sodda oziq muhiti: go’sht peptonli sho’rva, go’sht» peptonli agar va boshqalar;
2) maxsus tayyorlangan oziq muxiti: zardobli agar, zardobli sho’rva, ivib qolgan zardob, kartoshka, qonli agar, qonli sho’rva, astsetik sho’rva va astsetnk agar va boshqalar misol bo’ladi;
3) differentsial diagnostik ozik muxiti: bu gruppaga 1) mikro organizmlarshshg proteolitik xususiyatlarini aniklash uchui go’shtpeptonln jelatin; 2) uglevodlarning fermentativ xususiyatlarini aniqlash uchun oziq muhiti (giss ozig’i) miCOl bo’ladi; 3) gemolitik xususiyatlarni aniqlash uchun oziq muhiti (qonli agar).
4) mikroorganizmlarning qaytaruvchanlik xususiyatini aniqlash uchun oziq.
5) o’z tanasida ma’lum moddalar sintezlay oladigan mikroblar uchun oziq va boshqalar misol bo’ladi.
Hozirgi vaqtda ko’p oziqlar quruq xolda chiqarilmoqda, chunki ulardan foydalanish ancha qulay. Mikroorganizmlarni o’stirish uchun hozirgi vaqtda oqsilsiz oziqlardan keng foydalaniladi. Bunday muxitda ko’pchilik geterotroflar va patogen mikroblar yaxshi o’sa oladi.
Shunday oziqlar tarkibi murakkab bo’lib, ko’p komponentlardan tashkil topadi. Prototroflar juda oz miqdorda uglevodlar va tuzlar bo’lgan muxitda ham o’sa oladi. Auksotroflar esa o’z ozig’ida aminokislotalar va vitaminlar bo’lishini talab qiladi.
Oziq muhiti kattik (go’shtpeptonli agar, go’shtpeptonli jelatin, chirigan zardob, kartoshka, tuxum oqi), yarim suyuq (0,5% go’shtpeptonli agar) va suyuq (pepton suvi, go’shtpeptonli bulon, shakarli bulon) bo’ladi. Laboratoriyada bakteriyalar probirkalarda, Petri kosachalarida va kichik shisha idishlarda o’stiriladi. Zich oziq muhitida bakteriyalar turli shakldagi koloniyalar hosil kiladi: qirralari tekis, tekis bo’lmagan, do’ng, ichiga botgan, yumalok va hokazo.
Koloniyalarning diametri turlicha bo’lishi mumkin (4—5 mm bo’lsa katta, 2—4 mm bo’lsa o’rtacha, 1—2 mm bo’lsa kichik va 1 mm dan kichik bo’lsa mitti koloniya deyiladi). Koloniyalarning rangi ham turlicha bo’lishi mumkin, rangli, rangsiz, quruq va shilimshiq.
Fiksirlangan, bo’yalgan va tirik preparatlar tayyorlash. Boyitilgan va toza kulturalar haqida ma'lumotlar va ularni mikroorganizmlarni sistematikasi va fiziologo-biokimeviy xususiyatlarini o’rganishdagi ahamiyati.
Mikroorganizmlarni tekshrish vaqtida ishlatiladigan ozik-mahsulotlarni tekshirish metodlari.
Mikroorganizmlarni tekshirish va o’rganish va ularni bir-biridan ajratish uchun turli tuman oziqali kulturalar tayyorlanadi. Bular quyidagicha:
Peptonli go’sht sho’rvasi (PGSh). Bu sho’rvani tayyorlash uchun avvalo 500 g go’sht suyak, chandir va yog’dan tozalab maydalanadi. Maydalangan go’shtga 1 l suv qushilib 15 s temperaturada 24 soat tinch qoldiriladi. Bu vaqt o’tgandan so’ng go’sht aralashtirilgan suv doka orqali kolbaga filtrlanadi . Bu filtrat 30 minut qaynatiladi va issiqligicha filtrlanadi. 1 l go’sht sho’rvasi 10 g pepton va 5 g osh tuzi qo’shiladi. Qo’shilgan pepton eriguncha sho’rva isitiladi. Peptonli sho’rvani neytral holga keltirish uchun unga kristallik soda qo’shiladi. U loyqalanadi va tindirish uchun avtoklavlarga joylanib 120 gradusli issiqlikda 15-30 minut qizdiriladi. Bu sho’rva sovugandan so’ng ovqat muhiti sifatida ishlatiladi. Bu bakteriyalarning turini aniqlash uchun uncha qulay emas. Shuning uchun qattiq ozuqali muhit ishlatiladi. Qattiq oziq muhit sifatida jelatin va agar-agar ishlatiladi.
Go’sht-peptonli jelatin (GPJ).Bu oziq muhitni tayyorlash uchun 1 l go’sht-pepton sho’rvaga100-120 g maydalangan jelatin qushiladi. Sho’rvaga qo’shilgan jelatinni eritish uchun kolba Kox qaynatigichida yoki avtoklavda qizdiriladi. U avtoklavdan olinib filtrlanadi. Filtrat probirka yoki kolbalarga taqsimlanadi. Probirka va kolbalarni og’zi paxta bilan bekitiladi. U yana Kox qaynatgichida qaynatiladi bir sutkadan so’ng yana sterillanadi. GPJ asosan sovuq sharoitda ishlatiladi (24 gradus S u suyuladi).
Go’sht-peptonli agar-agar aralash ozuqali muhit (GPA).
Buning uchun tayyor agar poroshogidan 4 g tortib olinib 100 ml suvga solib qaynatib so’ngra sterillangan idishlarga solinadi va qotiriladi. Bundan tashqari tuganak bakteriyalar va achitqilarni o’stirish uchun achitqi suvi tayyorlanadi. Buning uchun svejiy yoki presslangan achitqidan 70-100 g tortib olinib 1 l disstillangan suvga solib eritiladi va 30 minut qizdiriladi. So’ngra katta silindrga solinib sovutiladi va filtrlanadi. Uni sterillash maqsadida yana Kox isitgichida 20 minutdan 2-3 kun qaynatiladi, so’ngra undan foydalaniladi.
Bundan tashqari yarim sintetik va sintetik ozuqa qo’llaniladi. Ko’pchilik Pseudoneoceas, Bacterium Mycobacterium va boshqalar asosan go’sht-peptonli oziqada o’stiriladi, ammo bundan tashqari sintetik ozuqali muhitda ham o’stirish mumkin.
SREDA № 1 (g/l)
Glyukoza - 20,0
MH₄Ce - 1.0
K₂NRO₄ - 0.5
Mg SO₄H₂O - 0/5
CaCo₃ - 20-30
P H sredы - 7.1-7.2
Mikroorganizmlar kulturasini tayyorlash uchun asosan uni shu yerda o’stirib ko’paytirishdir. Toza kultura bu mikroblarning faqat bitta turidan iborat. Aralash kulturasi – bu birinchi tabiatdan, ya’ni tuproqdan, havo va suvdan olingan aralash kulturasidir.
Elektiv kultura – bu biror to’pdan olib alohida ajratib biron suyuqlik yoki qattiq ozuqada o’stirilgandir. Bular biror bankada yoki probirkada saqlanadi. Buni saqlash uchun past temperaturada yoki ozuqasini almashtirib turiladi. Agar u uzoq muddatga saqlanmoqchi bo’linsa kultura qo’ritiladi havosiz joyda ularning biron ampulada og’zi kovsharlab quyiladi, yoki suyuq azotni ichida saqlanadi. Shunday qilib mikroblarning turli hil ozuqali kulturada o’stirib sof kulturasini ajratib mikroskopda o’rganishga mikrokultural metod deb yuritiladi.