|
Kerakli anjomlar va reaktivlar: 1.400 ml tungi pTi plazmmidli Agrobactrium tumefacines S58 va pRi plazmidli Agrobactrium rizogenes kulturasi.
10 ml STET buferi; 0,9 ml TES-buferi; 50 ml-li kolba; 1 ml lizotsim eritmasi (20mg/ml); sekundomer, 1 ml-li avtomat pipetkalar.
0,65 g. agaroza, 0,5 l elektroforez buferi, 12-21V "Bekman" sentrifugasi, 18-80 M "Bekman" ultratsentrifugasi, -200c haroratli muzlatgich kamera yoki -180c haroratlili muzlatgich, 1000c haroratli suv hammomi, muz hammomi, elektroforez apparati, doimiy tok manbai, xemiskop.
Shtamm va ozuqa muhitlar: Agrobactrium tumefacines va Agrobactrium rizogenes Ri A4 shtammlari, biomassa o‘stirish uchun (agarli) Xottikler yoki LV buloni.
Ishdan maqsad - Agrobakteriyalar Ti va Ri plazmid DNKlarini ajratish.
Tajriba rejasi. Bakterial hujayralar sentrifugada cho‘ktirilib, STET -buferida suspendirlanadi. Hujayradagi xromosoma DNKsi va oqsillarni cho‘ktirish uchun suspenziyaga lizotsim solib, qaynatiladi. Sentrifugalanib, denaturatsiyaga uchragan oqsillar va xromosoma DNKsi cho‘ktiriladi. Suyuq qismiga RNKaza fermenti bilan ishlov beriladi va plazmida DNKsi etanolda cho‘ktiriladi, so‘ng TES-buferida eritiladi va agarozali gel elektoroforezda taxlil qilinidi.
Ish tartibi. Bu tajribani bajarish uchun talabalar ikkitadan birlashadi. Har bir juft bitta shtammdan DNK ajratadi. Bir kun o‘stirilgan kultura (400 ml) 3000 aylana/daq. tezlikda 30 daqiqa sentrifugalanadi. Har bir kultura cho‘kmasi 10 ml STET - buferida suspendirlanadi va 50 ml-li Erlenmeyer kolbasiga solinadi. Suspenziyaga 1 ml lizotsimning suvdagi eritmasi (20 mg/ml) qo‘shiladi va tez aralashtirib aralashma isitgichga qo‘yiladi. Birinchi qaynash alomatlari ko‘rinishi bilan kolbani, 40 sekundga qaynab turgan suv hammomiga joylanadi, so‘ng olib tezlik bilan muz hammomiga 5 daqiqaga qo‘yiladi. Hosil bo‘lgan yopishqoq (shilimshiq) lizatni sentrifuga probirkalariga teng miqdorda solinib 25000 ayl/daq. tezlikda 40S da 30 daqiqa sentrifugalanib, xromosoma DNKsi va denaturatsiyalangan oqsillardan tozalanadi. So‘ng tiniq suyuqlik shisha sentrifuga probirkalariga solinadi va 10 mg/ml miqdordagi RNKaza bilan xona haroratida 1 soat inkubatsiyalanadi. Suyuqlikka teng miqdorda izopropanol qo‘shib, muzlatgichga -200C ga 1 soat qo‘yiladi. So‘ng 3000 ay/daq, tezlikda 20 daqiqa sentrifugalanadi. Cho‘kma havoda quritiladi va 0,9 ml TES -buferida eritiladi. Shu eritmadan 20 mkl olib agarozali gelda elektroforez ko‘yiladi va plazmidning borligi tekshiriladi. DNK eritmasiga 1g seziy xlorid solib, eritiladi va -40C da saqlanadi. 2-amaliy ish. Etidiy bromididli CsCl - gradientida plazmid DNKsini tozalash.
Makromolekulalar va viruslarning fizik-kimyoviy tahlilida CsCl gradienti zichligida ultratsetrifugalash usuli samarali foyda beradi. Tahlil qilinayotgan material CsCl eritmasi bilan aralashtirilib, aralashma gedimentatsion - diffuzion muvozanat hosil bo‘lgunicha setrifugalanishi, CsCl gradienti zichligining shakllanishining keng tarqalgan usuli hisoblanadi. Burchak rotorlardan foydalanilganda DNK ning suzish zichligida bo‘linishi uchun sentrifugalash vaqti 36-50 soatni tashkil etadi. Teng miqdorli gradient zichligi tezda shakllansa ham lekin asosiy vaqt DNK molekulasi teng og‘irliqdagi qatoriga yig‘ilishiga sarf bo‘ladi. Tahlil qilinayotgan material CsCl ning yuqorigi yoki pastki qatlamiga qatlamlanadigan zinasimon gradietining shakllanishi sentrifugalash vaqtini 12 soatga qisqarishini ta’minlashi mumkin. Zinasimon gradient uslubini qo‘llab vertikal rotorlardan foydalanilganida esa senrifugalash vaqtini 2 soatga qisqartirish mumkin. Burchak rotorlarida DNKniig suzish zichligi bo‘yicha tez bo‘linishining uslublari ishlab chiqilgan (6 soatda) [2]. Shu maqsadda, CsCl ning uch qatlamli o‘rta qatlamning yani arifmetik zichligi yuqorigi va pastki qatlamlarning zichligiga muallaq bo‘lgan gradienti shakllantiriladi va tahlil qilinayotgan material o‘rta qatlamga joylashtiriladi.Bunda makromolekullarning teng og‘irligidagi zichlikkacha migratsiya masofasi qisqarishi hisobiga makromolekular ajralishi tezlashadi.
Do'stlaringiz bilan baham: |
