1-amaliy mashg’ulot hujayra va to’qima kulturasini olish usullarini o’zlashtirish Hujayra va to‘qimalar kulturasi

Bakteriyalarning suyuq muhitda o‘sishi. Bakteriyalarning suyuq muhitda o‘sishini ta’riflash uchun kultura GPB ga yoki boshqa suyuq muhitga ekiladi. Mazkur muhit tekishirilayotgan shtammlarning o‘sishi uchun normal (me’yorida) bo‘lishi kerak. Ta’riflash uchun statsionar sharoitda o‘stirilgan 4-7 kunlik kulturalardan foydalaniladi. Bunda o‘sish tezligiga (sekin, o‘rtacha, avj olib), muhitning loyqalanishiga (bir xil, palaxsa-palaxsa, ipaksimon to‘lqinli), plyonkasi bor-yo‘qligiga (halqasimon yoki yalpi, yupqa yoki qalin, zich yoki g‘ovak, silliq yoki burmali, quruq yoki shilimshiq, devori bo‘ylab sirg‘aluvchi yoki sochilib ketadigan) e’tibor beriladi.
Bakterial shtammlarni saqlashni o‘rganish
Ko‘pgina bakterial shtammlar qopqog‘i buraladigan maxsus idishlarda 1-2 yil davomida yaxshi saqlanadi. Buning uchun hajmi katta bo‘lmagan flakonlarga 2-3 ml yarim suyuq agar (0,7%) quyiladi. Plazmidli shtammlarni saqlash uchun oziqa muhitiga antibiotiklar solinadi. Bakterial kulturalar sanchib ekilib, flakonlar qopqog‘i mahkam buraladi va 18-24 soat davomida kerakli temperaturada inkubatsiya qilinadi. So‘ngra kultura 40c da muzlatgichda saqlanadi. Bakterial shtammlarni uzoq vaqt mobaynida (ko‘p yillar davomida) saqlash past manfiy temperaturada, -200c da olib boriladi, -700c bo‘lsa yana ham yaxshi. Buning uchun kultura suyuq oziqa muhitida o‘stiriladi, 1-2 ml.dan flakonlarga quyib chiqiladi,
50% glitserindan oxirgi miqdori 15% gacha solinadi, flakon qopqog‘i mahkam yopiladi va yaxshilab aralashtiriladi. SHtammdan ekib olish kerak bo‘lgan hollarda mikrobiologik ilmoq yordamida suspenziya qirib olinadi (suspenziyani eritmasdan) va flakon yana muzlatgichga joylanadi.
7-AMALIY MASHG’ULOT
Mikroorganizmlardan nuklein kislotalar ajratish usullari
1-amaliy ish. Qaynatish usuli yordamida preparativ plazmid DNKsini ajratish.
Hozirgi vaqtda plazmid DNKsini olishning ko‘pgina uslublari mavjud. Barcha uslublar muolajalarida asosiy 3 ta jarayon amalga oshiriladi: bakterial hujayrlarni o‘stirish (iloji boricha plazmid DNKsi amplifikatsiyasini kuchaytirish), bakterial hujayralar lizisi va plazmid DNKsini tozalash. Plazmid DNKsini ajratish va tozalashning barcha uslublari xromosoma va plazmid DNKlarining fizik-kimyoviy hususiyatlarining farqiga asoslangan. Ikkinchidan plazmidlar hujayralardan kovalent yopiq shaklda ham ajratilishi mumkin, bunda xromosoma DNKsi ajratish jarayonida bir zanjirli bo‘laklarga bo‘linib ketadi. Bu DNK bo‘laklari odatda katta molekulyar og‘irlikka ega bo‘lib, ular ajratish jarayonida denaturatsiyaga uchragan oqsillar va hujayra qobiqlari bilan birga cho‘kmaga tushadi, plazmid DNKsi esa suyuqlik qismida qoladi (tiniq hujayra lizatida). Agar hujayralar lizisi hromosoma DNKsini tanlab denaturatsiya qiluvchi sharoitda olib borilsa plazmid DNKsining ko‘p miqdorda chiqishi ta’minlanadi. Buning uchun bakterial hujayralarga ishqor va issiqlik bilan ishlov beriladi. So‘ng denaturatsiyalanish mahsulotlar differensial sentrifugalash usuli yordamida cho‘ktiriladi. Bir qancha uslublar orqali hujayra lizatini tiniqlashtirib, so‘ng kerakli miqdorda plazmid DNKsining toza preparatlari olishdi va ularni transformatsiyalash va restriksiyalash tajribalarida ishlatish mumkin.
Gen muhandisligi maqsadlari uchun yuqori tozalikka ega plazmid DNKsi kerak. Buning uchun plazmid DNKsini preparati etidium bromidli CsClning zichligi gradientida ultratsentrifugalanadi. Etidium bromid DNKga o‘rnashib olib, seziy xlorid zichligi gradientida DNKniig suzish zichligini kamaytiradi. Etidiy bromadidning DNK bilan bog‘lanishi DNKning qaysi shakldaligiga bog‘liq DNKning to‘g‘ri shaklli molekulalari ko‘p miqdordagi, kovalent yopiq shakllari esa kamroq miqdordagi etidiy bromidid bilan birikadi. SHuning uchun etidiy bromididli CsCl gradientida DNKning to‘g‘ri shaklli va ochiq xalqali shakllariiing suzish zichligi kamayadi, aksincha esa xalqali kovalent yopiq DNK molekulalari zichligi kam miqdorda o‘zgaradi. SHunday qilib, etidiy bromididli CsCl gradientida ultratsentrifugalash DNK molekulalarini shakliga qarab ajralishiga olib keladi va shu bilan plazmida DNKsining tozaligini ta’minlaydi.