1 – laboratoriya mashg`uloti Laboratoriya mashg`ulot darsiga kirish va laboratoriya texnikasi bilan tanishtirish. Kafedra laboratoriyalarida ishlash xavfsizlik qoidalari

7 – laboratoriya mashg`uloti
Loviyadan nukleoproteidlarni ajratish
Ishning umumiy izohi. Fenol – detergent yordamida loviya kurtagidan umumiy RNK ajratib olinib, uning tozalik darajasi va unumini aniqlash.
Jihozlar va reaktivlar. Sentrifuga, hovoncha, aralashtirgich, 50 ml-li o‘lchov silindri, 10 ml-li pipetka yoki 10-20 ml-li shpritslar, standart tuzli eritma- 0,14 M Na (K)-sitrat, 200 ml etil spirti, suvga to‘yingan fenol, rN 6,0-li 10%-li Na-dodetsilsulfat (Na- DDS), xloroform, izoamil spirti, 5 g ungan loviya.
Ishning borishi. Loviyaning unib chiqqan qismini vodoprovod suvi bilan va keyin distilangan suv Bilan yaxshilab yuviladi. Undan 5 g olib,chinni hovonchada 50 ml standart tuzi eritmada gomogen holatga keltiriladi va gomogenatni 3-4 qavatli dokadan o‘tkaziladi. Bu gomogenatga 1%-gacha Na-dodetsilsulfat qo‘shiladi va aralashtiriladi va uning ko‘pirib ketmasligiga e’tibor berib, suvga to‘yintirilgan rN 6,0-li fenol qo‘shiladi. Aralashmani 60 ⁰S –gacha qizdiriladi va 30 minut davomida yaxshilab chayqatiladi, 0 ⁰S- +5 ⁰S atrofida sovutiladi va 15-20 minut davomida sentrifugalanadi. Bunda 3 ta qavat hosil bo‘ladi: suvli, fenol va cho‘kma. Suvli qatlam deproteinlashga uchragan RNK-dan tarkib topgan, uni shprits yordamida ajratib olinadi va teng hamdagi xloroform va izoamil spirti aralashmasi (24:1) bilan deproteinlanadi. Aralashmani fenol bilan ishlanganidek yaxshilab chayqatiladi, sentrifuga qilinadi va yuqoridagi suvli qavat ajratib olinadi. RNK suvli qavatdan 2,5 hamdagi spirt bilan cho‘ktiriladi (-10⁰S). Sentrifuga yordamida cho‘kmani ajratib olinadi va 10-20 ml standart tuzi eritmada eritiladi yoki boshqa bufer eritma ishlatish mumkin va 260, 280 va 230 nm-da yutilish qiymatlari aniqlanadi. A260/A230 va A260/A280 aniqlanadi. Birinchi nisbat RNK-ning polisaharidlardan, ikkinchisi oqsillardan tozalanish darajasini belgilaydi (≥2,00). 260 nm-dagi yutilish yordamida RNK konsentratsiyasi va hosil bo‘lgan miqdori aniqlanadi (260 nm-dagi 1 optik birlik qiymatga 42 mkg RNK to‘g‘ri keladi).