“амалий молекуляр зоология” Маърузачи: б ф. д., проф. Абдурахим Эргашевич кучбоев

“АМАЛИЙ МОЛЕКУЛЯР ЗООЛОГИЯ” Маърузачи: б.ф.д., проф. Абдурахим Эргашевич КУЧБОЕВ  

ЎЗБЕКИСТОН РЕСПУБЛИКАСИ
ОЛИЙ ВА ЎРТА МАХСУС ТАЪЛИМ ВАЗИРЛИГИ
ЎЗБЕКИСТОН МИЛЛИЙ УНИВЕРСИТЕТИ
БИОЛОГИЯ ФАКУЛЬТЕТИ
Зоология кафедраси

9- МАВЗУ: ПЛАЗМИДА ДНКСИ АЖРАТИШ. РЕСТРИКЦИОН ТАҲЛИЛ   РЕЖА   Плазмида ДНКсини Fermentas Gene тўпламлари ёрдамида ажратиш. Рестрикция реакциясини ўтказиш принциплари. ВА ТРАНСФОРМАЦИЯ ҚИЛИШ

ПЛАЗМИДА ДНКНИ АЖРАТИШ

• ПЛАЗМИДА ДНКНИ АЖРАТИШ
• Инкубациядан кейин плазмида ДНКсини бактериал ҳужайралардан ажратиш керак. Ишлаб чиқарувчи томонидан тавсия этилган тартибда турли хил тўпламлар ёрдамида бактериал ҳужайралардаги плазмида ДНКсини ажратиб олиш мумкин.

Вазифа 1. Fermentas Gene JETTM Plasmid Miniprep Kit # K050 тўпламида плазмида ДНКсини ажратиш

• Вазифа 1. Fermentas Gene JETTM Plasmid Miniprep Kit # K050 тўпламида плазмида ДНКсини ажратиш
•  
• 1,5 мл бактерия културасини 1,5 мл центрифуга пробиркасига ўтказинг, 30 секундда максимал тезликда (13,0 минг айланиш тезлиги) центрифуга қилинг, микропипетка ёрдамида супернатантни олиб ташланг.
• Чўкмага 250 мкл Buffer PI қўшинг (- 4°C да сақланади), чўкма эримагунча вортексда аралаштиринг.
• 250 мкл Buffer P2 лизис буферини қўшинг (таркибида SDS ва NaOH ионларини мавжуд детергент; қўшилганда ҳужайра мембранаси йўқ қилинади), 1,5 мл пробиркани 6 марта ағдарилган ҳолда айлантиринг. Вортексга аралашманг!
• 350 мкл нейтралловчи буфер Buffer P3 (таркибида натрий ёки калий ацетати мавжуд) қўшинг, 1,5 мл пробиркани 6 марта ағдарма ҳолда айлантиринг.
• Максимал тезликда 5 дақиқа давомида центрифуга қилинг.
• Эҳтиёткорлик билан супернатантни сорбентли колонкага ўтказинг.
• Колонкани 2 мл центрифуга пробиркасига жойлаштиринг.
• Колонкани 2 мл пробиркада 1 минут давомида максимал айланиш тезлигида центрифуга қилинг. 2 мл пробиркадаги центрифугатни (чўкмани) тўкиб ташланг.
• Колонкага 500 мкл ювиш буффери Buffer PB (таркибида C2H5ОH) қўшинг.
• Колонкани 2 мл пробиркада 1 минут давомида максимал айланиш тезлигида центрифуга қилинг. 2 мл пробиркадаги центрифугатни тўкиб ташланг.

Колонкага 750 мкл ювиш буферини Buffer PE қўшинг.

• Колонкага 750 мкл ювиш буферини Buffer PE қўшинг.
• Колонкани 2 мл пробиркада 1 минут давомида максимал айланиш тезлигида центрифуга қилинг. 2 мл пробиркадаги центрифугатни тўкиб ташланг.
• Ювиш буфферини тўлиқ олиб ташлаш учун колонкани яна 2 мл пробиркада 1 минут давомида максимал тезликда центрифуга қилингг.
• Колонкани янги 1,5 мл центрифуга пробиркасига ўтказинг, колонкага 50 мкл элюция буферини Elution Buffer қўшинг. Хона ҳароратида 1 дақиқа давомида инкубация қилинг.
• Колонкани 1,5 мл пробиркада 1 минут давомида максимал айланиш тезлигида центрифуга қилинг. Плазмида ДНКси 1,5 мл пробиркада қолади, колонкани ташлаб юборинг.
• Тўплам билан ажратилган плазмид ДНКсини + 2°C дан + 4°C гача ҳароратда ёки -15°C дан -25°C гача ҳароратда сақлаш керак.

РЕСТРИКЦИОН ТАҲЛИЛ

• РЕСТРИКЦИОН ТАҲЛИЛ
•  
• Рестриктаза (чеклов) ферментлари - бу икки занжирли ДНКдаги маълум бир кетма-кетликни тан оладиган ва сайт ичидаги ёки ёнидаги ДНКни гидролиз қиладиган эндонуклеазлар. Камида 1 минг рестриктаза ферментлари маълум. Рестриктаза ферментларининг 3 типга ажратилади:
• I тип ва III тип - занжирида иккита фаолиятни амалга оширувчи оқсил молекуласи, рестриктаза ва модификатор. Рестриктаза АТФ энергиясини талаб қилади.
• II тип - 2 турдаги протеинлар: рестриктаз ва модификацияловчи ферментлар. Рестриктаза АТФ талаб қилинмайди.