Ўзбекистон республикаси олий мажлис сенати аграр, сув хўжалиги масалалари ва экология

 
 Фойдаланилган адабиѐтлар: 
1. Arias D.M., Rieseberg L. H. Genetic relationship among domesticated and wild sunflowers (Helianthus 
annuus, Asteraceae) // Econ. Bot. 1995, V. 49, №3. P. 239-248. 
2. Азизов Т.Б., Анарбаев И.У. Кунгабоқардан мўл ҳосил етиштириш бўйича тавсиялар. –Тошкент. -20 б. 
3. Доспехов Б.Д. Методика полевых опыта (4-ое изд.). – М.: Колос, 1986. - 415 с. 
 
СОЗДАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ РАСТЕНИЙ, НЕ НЕСУЩИХ СЕЛЕКТИВНЫЕ 
МАРКЕРЫ 
 
А.С.Имамходжаева, Х.М.Абдираимова, Е.В.Никитина 
Центр геномики и биоинформатики АН РУз. 
Биотехнология и генная инженерия, в частности, играют огромную роль в развитии 
сельскохозяйственной отрасли. С их помощью созданы десятки улучшенных, высокоурожайных, 
устойчивых к абиотическим и биотическим факторам сортов сельскохозяйственных культур, которые 
выращиваются на более чем 170 млн. га по всему миру. 
В процессе создании нового или улучшенного генотипа методами генной инженерии, как правило, 
используют векторные конструкции. И в этих конструкциях, обязательно включали селективные гены, 
позволяющие проводить первичный отбор трансформантов в селективных условиях. Такими генами 
являются 
гены 
устойчивости 
к 
антибиотикам 
(неомицинфосфотрансферазе 
(nptII) 
и 

---

259 
гигромицинфосфотрансферазе (hpt), β-лактамазе (
bla
), аминогликозид-3'-аденилтрансферазе (
aadA
)), или к 
гербицидам (гигромицину, глифосат оксидоредуктазе, ацетолактат синтетаза или фосфинотрицину). Эти 
гены позволяют отличить и в дальнейшем изолировать трансформированные клетки от 
нетрансформированных [1]. Эти гены выполняют селективную функцию на этапах выращивания 
культуры клеток на искусственных средах. Однако, после трансформации, эти гены не обладают значимой 
функцией для самого регенерированного организма, куда была трансформирована генетическая 
конструкция[2]. В связи с этим их стали называть «генетическим мусором».
В связи с тем, что после завершения отбора трансформированных клеток (например, клеток 
растений, которые должны регенерировать в целый организм) присутствие в их геноме селективных 
маркерных генов становится бесполезным, а их эффект непредсказуемым и даже потенциально опасным, 
поднята задача удаления таких фрагментов из генома регенеранта. 
На сегодняшний день одним из актуальных направлений биотехнологии растений является 
разработка стратегии удаления селективных генов, привнесенных в ходе трансформации, и создание 
растений свободных от селективных генов, и в частности, генов антибиотикоустойчивости [3]. 
Ученые приводят множество причин, побуждающих создавать трансгенных растений, содержащих 
как можно меньше чужеродных ДНК, или так называемого "генетического нефункционального груза". Не 
исключали и возможность горизонтального переноса генов устойчивости к антибиотикам кишечной 
микрофлоре животных и человека, а также вертикального переноса генов устойчивости гербицидам 
сорным растениям. 
На основании международных публикаций можно сделать прогноз, что подобно тому, какими 
темпами развивалась в 1980-1990 гг. технология трансформации, с такой же скоростью будут развиваться 
и технологии удаления «ненужных» генов [4]. Поскольку селективные маркеры не несут какой-то 
определенной функции после селекции, то являются очевидными кандидатами на удаление. Разработка 
стратегий для устранения селективных маркерных генов и создания свободно маркерных растений это 
область исследований, которая развивается быстрыми темпами. 
На сегодня уже разработаны и применяются различные подходы получения трансгенных растений 
без селективных генов [5, 6, 7, 8, 9, 10]. На основе изучения феномена встраивания векторных 
последовательностей разработаны рекомендации для создания различных генетических конструкций, 
позволяющих избежать встраивания, как фрагментов вектора, так и генов устойчивости к антибиотику.
Для производства растений, не содержащих в геноме селективных генов, в мировой литературе 
предлагается несколько методов [11, 12]. Объектами такого производства, в основном, являлись 
трансгенные растения табака, кукурузы, сои, пшеницы, томата - то есть растения, непосредственно 
употребляемые в пищу. Однако в большинстве случаев эти методы являются достаточно трудоемкими и 
требуют значительного времени для отбора таких растений.
Эти методы основаны на вырезании последовательности селективного гена посредством различных 
рекомбинаций: например, применение систем гомологичной и сайт-специфической рекомбинации 
Cre/lox, FLP/ FRT или R/Rs, вырезающие маркерные гены у полученных растений [13, 14]. Выщепление 
селективного гена из трансгенных растений табака с помощью способа Cre/lox впервые показано в 1991 
году, однако до последнего времени он не находил применения для получения безмаркерных 
коммерческих растений.
В зарубежной литературе описан способ создания безселективных трансгенных растений табака 
(
Nicotiana tabacum cv. xanthi
) и гибрида тополя (
Populus sieboldii
x 
Populus grandidentata
), основанный на 
использовании векторной системы MAT (Multi-Auto-Transformation). Для трансформации растений 
использовали штамм 
Agrobacterium tumefaciens
P022, содержащий вектор pNPI106. В этом способе 
использовали агробактериальный ген ipt в качестве селективного маркера роста трансформированных 
растений на средах без специфических гормонов. Для вырезания гена ipt использовали транспозон Ас. 
Однако недостатком способа является то, что необходимо встраивание маркерного гена только в одной 
копии. Из-за этого эффективность отбора безмаркерных растений падает. Необходимо проведение 
дополнительных анализов для отбора растений с одной копией гена. 
К трансгенному растению картофеля 
Solanum tuberosum
L., применили способ, основанный на 
использовании селективных генов для позитивной (ген неомицинфосфотрансферазы nptII) и негативной 
(ген цитозиндезаминазы codA) селекции на одной плазмиде и целевого гена - на другой [12]. Для 
трансформации растений использовали штамм 
Agrobacterium tumefaciens
AGL0, содержащий вектор 
PROGMO. Временная позитивная селекция трансформированных растений на среде с канамицином 
сменялась этапом негативной селекции на среде с 5-фторцитозином, что приводит к отбору растений, 
содержащих с частотой до 15% только целевой ген. Недостатком способа является значительная 
длительность проведения из-за необходимости дополнительных анализов ДНК безмаркерных растений 
методами ПЦР и ДНК-гибридизации по Саузерну. 

---

260 
С целью освобождения от селективных генов разработаны также новые серии трансформационных 
векторов, содержащих транспозируемые элементы (ТЭ). Для получения безселективных растений 
предлагается также котрансформация их отдельными векторами для целевого и маркерного генов с 
последующим разделением этих генов в процессе полового скрещивания растений, что является 
достаточно длительным. 
Перечисленные выше стратегии, как правило, не дают возможности получения безселективных 
трансгенных растений за короткий промежуток времени, имеют своего рода недостатки и для их 
выполнения необходимо проведение дополнительных анализов с целью отбора растений с одной копией 
гена. Тем не менее, вышеперечисленные методы преемлимы для рассмотренных нами культур.