Учебная литература медицинских вузов для студентов

Задание студентам
Микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим и тинкториальным свойствам в го­товом препарате из смеси бактерий (окраска по методу
Грама). Зарисовать.
Самостоятельно приготовить мазки из смеси бакте­рий, окрасить по методу Грама, Микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим признакам и тинкториальным свойствам. Зарисовать.
Микроскопировать и зарисовать:
капсулы (окраска по методу Бурри—Гинса);
С.diphtheriae, содержащие зерна волютина (окраска по методу Нейссера);
кислотоустойчивые бактерии М. tuberculosis (окраска по методу Циля—Нильсена);
спорообразующие бактерии (окраска по методу Шеффера—Фултона).
4. Сделать заключение по результатам проведенных исследований.


Методические указания
Сложные методы окраски. Сложные методы окраски исполь­зуют для выявления ультраструктурных компонентов бактери­альных клеток, имеющих достаточно большие размеры (мак­рокапсулы, жгутики, цитоплазматические включения и т.д.), а также для дифференцировки (различения) бактерий в зависи­мости от химического состава и особенностей их тонкой орга­низации (ультраструктуры).
Окраска по методу Грама
На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильт­ровальной бумаги. Через 1—2 мин ее снять, а краситель
слить.
Нанести раствор Люголя на 1-2 мин.
Обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.
Промыть водой.
Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин, промыть водой, высушить и Микроскопировать.
Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фио­летовый цвет, грамотрицательные — в красный (рис. 2.2.1; на вклейке). В основе этого метода лежит избирательное обесцве­чивание — удаление комплекса генцианового фиолетового с йодом под действием спирта. Результат окраски по методу Грама определяется особенностями строения и химического состава клеточной стенки бактерий и зависит от способности удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового с йодом.
Фирмикутные бактерии окрашиваются грамположительно, поскольку имеют многослойный пептидогликан, связанный с тейхоевыми кислотами. Последние обусловливают прочную фиксацию красителя и резистентность к обесцвечиванию спир­том. Грациликутные бактерии окрашиваются грамотрица-тельно.
Окраска по методу Грама имеет важное дифференциально-диагностическое значение и широко используется в микробио­логии. К грамположительным бактериям относятся стафило­кокки, стрептококки, коринебактерии дифтерии и др., к грамотрицательным — гонококки, менингококки, кишечная палоч­ка и др. Некоторые виды бактерий (клостридии, гарднереллы) могут окрашиваться по методу Грама вариабельно в зависимос­ти от возраста культуры, особенностей культивирования и дру­гих факторов, воздействующих на структуру клеточной стенки.
Основная ошибка, допускаемая при окраске по методу Гра­ма, заключается в "переобесцвечивании" мазка этиловым спиртом. Грамположительные бактерии при этом могут утра­чивать первоначальную окраску генциановым фиолетовым и приобретать красный цвет (характерный для грамотрицатель-ных бактерий) в результате последующей докраски мазка фук­сином. Грамотрицательные бактерии в свою очередь могут сохранять сине-фиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблюдать технику обесцвечивания.
Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Ниль­сена
На фиксированный мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подо­греть 3-5 мин до появления паров.
Снять бумагу, промыть мазок водой.
Нанести 5 % раствор серной кислоты или 3 % раствор смеси спирта с хлористоводородной кислотой на 1-2 мин. для обесцвечивания.
Промыть водой.
Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин.
Промыть водой, высушить и микроскопировать.
В основе метода лежат протравливание (разрыхление) кле­точной стенки бактерий для усиления поглощения красителя и избирательное обесцвечивание под действием кислоты. Кис-лотоустойчивость бактерий обусловлена особым строением их клеточной стенки с повышенным содержанием липидов: разветвленных жирных кислот (миколовых кислот), глико- и фос-фолипидов, восков. Клеточная стенка кислотоустойчивых бак­терий имеет очень низкую проницаемость, поэтому они пло­хо воспринимают красители. Раствор карболовой кислоты разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает ее тинк-ториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливают реакцию взаимодей­ствия красителя с бактериальными клетками, которые при этом окрашиваются в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой некислотоустойчивые бактерии обесцвечива­ются и в дальнейшем окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а кислотоустойчивые бактерии остаются окра­шенными фуксином в красный цвет (рис. 2.2.2; на вклейке).
Окраска спор по методу Ожешко
На нефиксированный мазок нанести 0,5 % раствор хло­ристоводородной кислоты и подогреть в течение 2-3 мин. на пламени.
Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем.
Окрасить по методу Циля-Нильсена.
Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы — синий (рис. 2.2.3; на вклейке). Споры бактерий име­ют многослойную клеточную стенку сложного строения, прак­тически непроницаемую для красителей, поэтому для повыше­ния их тинкториальных свойств используют более жесткие условия протравливания, чем для окрашивания кислотоустой­чивых бактерий.
Окраска спор по методу Шеффера-Фултона
На фиксированный мазок нанести 5 % раствор малахитового зеленого и 3-4 раза нагреть до появления паров.
Промыть водой.
Докрасить 0,5 % сафранином в течение 30 с.
4. Промыть водой, высушить и микроскопировать. Споры бактерий окрашиваются в зеленый цвет, вегетатив­ные клетки — в красный.
Окраска зерен волютина по методу Нейссера
На фиксированный мазок нанести ацетат синьки Нейссера на 2-3 мин.
Добавить раствор Люголя на 10-30 с.
Промыть препарат водой.
Докрасить водным раствором везувина или хризоидина в течение 0,5-1 мин.
Промыть препарат водой, высушить и микроскопиро­вать.
Зерна волютина представляют собой включения полифос­фатов, имеющие в отличие от цитоплазмы щелочную реакцию, и поэтому избирательно воспринимают ацетат синьки, окра­шиваясь в темно-синий цвет. Цитоплазма клетки, обладающая кислой реакцией, воспринимает щелочной краситель везувин и окрашивается в желтый цвет (рис. 2.2.4; на вклейке). Обнаружение макрокапсул по методу Бури-Гинса
Смешать каплю взвеси микробных клеток с каплей туши и при помощи стекла со шлифованым краем сделать мазок таким же образом, как мазок из крови, высушить и фиксировать.
На мазок нанести водный раствор фуксина на 1—2 мин.
Промыть водой, высушить на воздухе и микроскопировать.
Бактерии окрашиваются в красный цвет. Капсулы не окра­шиваются анилиновыми красителями, остаются прозрачными и контрастно выделяются на черно-розовом фоне (рис. 2.2.5; на вклейке).