Учебная литература медицинских вузов для студентов

Тема 2.1. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ БАКТЕРИЙ И ИХ ТИНКТОРИАЛЬНЫХ СВОЙСТВ. ПРОСТЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ
План
Программа
Морфология бактерий и методы ее изучения.
Подвижность бактерий и методы ее изучения.
Простые методы окраски препаратов.
Определение размеров бактерий.
Демонстрация
Приготовление мазков из бактериальных культур.
Красители, используемые в микробиологии.
Подвижность бактерий в препарате "висячая" капля.
Задание студентам
Микроскопировать и зарисовать готовые мазки, окра­шенные простым методом (стафилококки, стрептококки, сарцины, палочки, стрептобациллы).
Приготовить мазки из бактерий, выращенных на жид­кой и плотной питательных средах.
Окрасить мазки простым методом.
Микроскопировать и дифференцировать бактерии в мазках по основным морфологическим признакам и зарисовать их. 5. Определить размеры бактериальной клетки.
Методические указания
Приготовление препаратов для микроскопического исследова­ния. Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой. В некоторых случаях исполь­зуют препаровальные иглы.
Петлю прокаливают в пламени горелки для уничтожения посторонних бактерий. Вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, прижимая ее V и IV пальцами к ладони, и обжигают край пробирки. Осторожно вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность стекла, после чего легким скользящим движением захватывают мате­риал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают край пробирки и закрывают пробкой. После приготовления препарата петлю обязательно прожигают (стерилизуют) в пла­мени. Жидкий материал из пробирки или колбы можно наби­рать пипеткой.
Приготовление нативных препаратов для прижизненного изу­чения микроорганизмов. Метод "висячей" капли. Пре­парат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю исследуемого материала. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном пре­парате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии вначале используют объек­тив малого увеличения (8х или 10х), находят край капли, а затем устанавливают объектив 40х или иммерсионный и ис­следуют препарат. Определяют подвижность бактерий.
Метод "раздавленной" к а пли. На поверхность обез­жиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла.
Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь мик­роорганизмов вносят в каплю 0,001 % раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем готовят препарат "висячая" или "раздавленная" капля и микроскопируют.
После микроскопии препараты "раздавленной" или "вися­чей" капли опускают в дезинфицирующий раствор.
Приготовление фиксированных препаратов-мазков. Для при­готовления препарата на обезжиренное предметное стекло на­носят суспензию (взвесь) бактерий. Если мазок готовят из
жидкой питательной среды, то материал непосредственно на­носят петлей на предметное стекло и распределяют его так, чтобы получить тонкий мазок. В других случаях первоначально на предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуе­мый материал и готовят взвесь. При правильном распределе­нии материала в мазке при микроскопии видны изолирован­ные бактериальные клетки. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки, не давая капле закипать.
Фиксация препарата. Высушенные мазки подвергают термической или химической обработке, в результате которой бактерии погибают и плотно прикрепляются к поверхности стекла. Обычно для фиксации мазка предметное стекло про­водят несколько раз через пламя горелки (мазком вверх).
Мазки крови, мазки-отпечатки из органов фиксируют по­гружением на 5-20 мин в метиловый или этиловый спирт или другие фиксирующие жидкости.
Окраска препаратов простым методом. Фиксированный мазок окрасить каким-либо одним красителем, например фук­сином водным (1-2 мин) или метиленовым синим (3-5 мин), промыть водой, высушить и микроскопировать.
Приготовление и окраска препаратов для люминесцентной микроскопии. Для люминесцентной микроскопии на предмет­ных стеклах готовят фиксированные препараты-мазки или на-тивные препараты, которые окрашивают специальными флю­оресцентными красителями: акридиновым желтым, акридино­вым оранжевым, ауромином, корифосфином. При работе с иммерсионным объективом используют нефлюоресцирующее масло.
Приготовление препаратов для электронной микроскопии. Приготовление препаратов для исследования в электронном микроскопе имеет ряд особенностей. Препараты готовят на специальных пленках-подложках, так как стекло непроницае­мо для электронов. Исследуемый объект максимально очища­ют от посторонних примесей и наносят на пленку-подложку, предварительно помещенную на опорную металлическую се­точку. Для контрастирования применяют соединения тяжелых металлов (золото, осмий, рутений и др.).
Измерение микробных клеток. Измерение микробов осущест­вляют в ходе микроскопического исследования с помощью специальных приспособлений. Для измерения применяют оку­ляр-микрометр и объект-микрометр. Окуляр-микрометр слу­жит для непосредственного измерения объекта и представляет собой стеклянную пластинку в окуляре, в центральной части которой нанесена шкала с 50 делениями. Объект-микрометр представляет собой стекло, в середине которого имеется эта­лонная шкала, разделенная на 100 частей. Цена деления шкалы

Форма Разме- Окраска Наличие Кислого- Под-клеток ры по мето- устойчи- виж-ду Грама ^СПОР ^кап" зерен вость ность сул волю-тина

Спорообразующие бактерии (окраска по методу Шеффера—Фултона).

Зерна волютина в клетках Corynebacterium diphtheriae (окраска по методу Нейссера).