Termiz davlat universteti tabiiy fanlar fakulteti

2.2. DNK SNPlex markerlari.

- SNP (bitta nukleotidli polimorfizm - mononukleotidli polimorfizm) - bu genomik DNKdagi mononukleotid holati, buning uchun populyatsiyada ketma-ketlikning turli xil o'zgarishlari (allellar) noyob alleli kamida 1% uchraydi: AAAACAA va AAAATAA - farq. bitta nukleotid ikkita allel (C va T) mavjudligini bildiradi. Bu usul allelik polimorfizmni o'rganish, urug 'tozaligini sinash, haplotip va nasl-nasabni tahlil qilish, shuningdek genotiplash va genetik xaritalarni tuzishda keng qo'llaniladi [27] va boshqalar.

SNPlarni ketma-ketlik kabi usullar bilan aniqlash mumkin, bu juda qimmat, CAPS markerini yaratish, bitta nukleotid o'rnini bosish uchun qidiruv dasturlashtirilgan allelga xos real vaqtda PCR va SNP massivlari.

So'nggi usulni ko'rib chiqing (DNK chipi - berilgan ketma-ketlik bilan unga qo'llaniladigan mono-torli DNK qismlari bo'lgan mini-plastinka), ulardan foydalanish uch bosqichni o'z ichiga oladi:

• DNK chiplarini yaratish (yoki sotib olish);

• DNK ekstraktsiyasi, DNK chiplari bilan keyingi duragaylash uchun DNKni qayta ishlash; • natijalarni yig'ish va tahlil qilish [25]. Ushbu usulning kamchiliklari va afzalliklari.

DNK chiplarining asosiy afzalliklariga quyidagilar kiradi: nisbatan kam miqdordagi boshlang'ich materialdan foydalanish qobiliyati; ishonchlilik; bitta nukleotidli polimorfizmlarning yuqori zichligi va evolyutsion barqarorligi tufayli markerlardan foydalanish qulayligi; yuqori ma'lumot tarkibi; tahlilni to'liq avtomatlashtirish qobiliyati; genomik tanlov uchun mos; SNP tadqiqot jarayonida qiziqish ko'rsatadigan genlarda yoki ularda joylashgan; merosning kodominant turi.

SNP-massivining kamchiliklari: SNPni aniqlash bilan bog'liq texnik qiyinchiliklar; yuqori narx; ketma-ketliklar va yonbosh sohalarni bilishga bo'lgan ehtiyoj. Mikroelementlarga asoslangan marker tizimlari bilan bog'liq yana bir marker bu DArT markeridir (Diversity Array Technology - genetik polimorfizmni o'rganish uchun DNK chip usuli). Yuqorida keltirilgan marker populyatsiyalar tarkibini kuzatish, genetik xilma-xillikni o'rganish, navlarni, miqdoriy joylarni (QTL) va naslchilik uchun markerlarni aniqlash, shuningdek genetik xaritalarni tuzish uchun ishlatiladi.

DArT-texnologiyasi polimorf DNK fragmentlarini aniqlashga asoslangan. DArT chipi quyidagicha tayyorlanadi:

• DNKni cheklash va bog'lash yo'li bilan DNK namunalarini ajratish va tayyorlash;

• olingan materialni polimorf bo'lmagan va polimorf bo'laklarga bo'lish;

• polimorfik parchalarni klonlash va ularni konvertatsiya qilish yo'li bilan tanlash

E. coli;

• genlar kutubxonasini yaratish uchun tanlangan polimorfik qismlarni kuchaytirish, so'ngra ko'k ftorofor bilan bo'yash va shisha disklarga surish, natijada DArT chipi hosil bo'ladi.

Ushbu mikrosxemalar asosida gibridizatsiya tayyorlangan "DNK nishonlari" bilan genomik vakillik orqali amalga oshiriladi va yashil florofor bilan etiketlanadi. Keyinchalik chiplarni skanerlash va har bir marker uchun lyuminestsentsiya intensivligini o'lchash keladi.

DArT texnologiyasi SNP-dan farq qiladi, chunki u chip dizayni uchun genom ketma-ketligi ma'lumotlarini talab qilmaydi. AFLP va SSR bilan taqqoslaganda, u yanada aniqroq va samaraliroq.

Biroq, bu usul kamchiliklardan xoli emas. DArT murakkab uskunalarni talab qiladi, ammo tahlil xarajatlari nisbatan past.

Yosh "yoshga" qaramay, DArT chiplari yordamida ko'plab ilmiy tadqiqotlar olib borildi.

Xitoyda olib borilgan ilmiy izlanishlar tamaki uchun DArT chipini ishlab chiqishga olib keldi, u Xitoy va boshqa mamlakatlarning 267 mintaqalashtirilgan navlarini filogenetik tahlil qilishda hamda tamakining genetik xaritasini tuzishda muvaffaqiyatli ishlatildi.

DArT markerlari genomik selektsiyada qo'llaniladi, bu esa bug'doy va guruch uchun chiplarni ishlab chiqarishga olib keladi va hokazo. - ISSR (Inter Simple Sequence takrorlashlari - mikrosatellitik ketma-ketliklar) - DNK genomining oddiy ketma-ketliklari takrorlanishi o'rtasida kuchayish amalga oshiriladigan usul. ISSR markerlari RAPD uslubiga alternativa sifatida ishlab chiqilgan, ammo farqi shundaki, ular tomonidan aniqlangan polimorfizm yuqori va aniq takrorlanadi. Shunday qilib, ISSR usuli berilgan mikrosatellit ketma-ketligini to'ldiruvchi (4-12 takroriy birlik) primer ishtirokida ikkita mikrosatellit takrorlash bilan cheklangan klonlash ketma-ketliklariga asoslangan va bir uchida ikkitadan to'rttagacha tasodifiy nukleotidlar ketma-ketligini ko'tarish ( langar deb ataladi). Ushbu primerlar ikkita qo'shni mikrosatellitalar qatori o'rtasida joylashgan DNK mintaqalarini nusxalashga imkon beradi. Natijada, elektroforemada ISSR barmoq izlari bilan ko'rsatilgan mintaqalarning katta qismi klonlashtiriladi. PCR mahsulotlarining olingan namunalari ma'lum darajada ma'lum darajada o'ziga xosdir, shuningdek, ular RAPD markerlariga qaraganda ancha ishonchli [16, 23, 24].

ISSR-tahlil madaniy o'simliklarning genetik xilma-xilligini baholashda samarali bo'ladi, ma'lum bir primerni tanlayotganda ko'paytirish va ketma-ket bo'laklarga ehtiyoj yo'q, nukleotidlar ketma-ketligi to'g'risida bilim talab etilmaydi va genetik tahlil uchun qulaydir. Bundan tashqari, usulning afzalliklari past narx va soddaligi. Yuqoridagi ijobiy fazilatlar tufayli ISSR markerlari hozirgi paytda eng keng tarqalgan.

Shu bilan birga, ushbu uslubning kamchiliklari ham bor: ISSR primer ketma-ketliklarini yanada aniqroq tanlash va tahlil jarayonida faqat "yorqin" ISSR kuchaytiruvchi mahsulotlaridan foydalanish zaruriyati [18, 25]; homo- va heterozigotlikni aniqlashga imkon bermaydigan ustunlik [26]; qayta kuchaytirish jarayoni ikkilamchi nusxa ko'chirish bo'lib, reaksiya sharoitlarini o'zgartirib, amplikonlar sonini ko'paytiradi, masalan, kuyish harorati [25].

ISSR usuli asosida juda ko'p ilmiy ishlar olib borildi: L. bienne Mill (ikki yillik zig'ir) turlarining genetik xilma-xilligini o'rganish; regenerant o'simliklarning bir-biri bilan chambarchas bog'liq genotiplari o'rtasidagi genetik farqlarni aniqladi va ularning tegishli ota-ona o'simliklariga tegishli ekanligini aniqladi; ISSR markerlari (Inter Simple Sequence takrorlashlari) DNKning shtrix kodlash markerlari bilan birgalikda ko'plab madaniy o'simliklarda filogenetik munosabatlarni tiklash uchun ishlatilgan.

Anjir. 2. RFLP (inglizcha cheklash bo'lagi uzunligining polimorfizmi - cheklash qismlari uzunligining polimorfizmi - RFLP)

RFLP tahlili quyidagicha davom etadi:

• sinov materialining to'qimasidan DNKni ajratish;

• DNKning cheklanishi;

• cheklash mahsulotlarini elektroforetik aniqlash va ajratish;

• Southern Blotting usuli - olingan DNK mintaqalarini membranalar ustiga qo'llash, keyinchalik markalangan prob bilan gibridlash;

• radio avtograflarda pozitsiya bo'yicha tahlil qilish [14, 15,16].

RFLP asosiy oqim uchun birinchi usul sifatida ishlab chiqilgan. Bundan tashqari, ushbu usul bir qator afzalliklarga ega, masalan, ishonchlilik, turli laboratoriyalarda sinov o'tkazish qobiliyati, homomen va heterozigotlarni ajratib olishga imkon beradigan kodominans, nukleotidlar ketma-ketligi haqida ma'lumot talab etilmaydi, genetik xaritalarni tuzish, ayrimlarining fiziologik, morfologik va ekologik jihatdan genomik yorliqlari. muhim xususiyatlar [17, 18].

Biroq, shu bilan birga, RFLP-ning kamchiliklari ham bor, shuning uchun bu usul kamroq va kamroq qo'llaniladi: ko'p miqdordagi DNKga ehtiyoj; ko'p vaqt va pul talab qiladi (Janubiy gibridizatsiyadan foydalanganda); RFLP markerlarining genom bo'ylab notekis taqsimlanishi va boshqalar.

- SSR markerlari ((mikrosatellitlar) ing. Simple Sequence Repeats - oddiy takrorlanadigan ketma-ketliklar) - 2-6 nukleotid uzunlikdagi qisqa tandem takrorlanishlaridan (genom parchalari) iborat DNK mintaqalari.

Oddiy genom ketma-ketliklarini marker sifatida ishlatishni birinchi bo'lib 1989 yilda nemis tadqiqotchisi Dietxard Tutz taklif qilgan. SSR markerlari fileografiya, populyatsiya tuzilishi, navlarini aniqlash va ota-ona shakllarini aniqlash uchun ishlatiladi. Hozirgi kunda mikrosatellitlar tur ichidagi o'simliklarni differentsiatsiyasi, navlarini DNK identifikatsiyasi, genetik xaritalarni tuzish, qishloq xo'jaligi o'simliklarining genetik xilma-xilligini o'rganish, ularni sertifikatlash, shuningdek marker tanlashda foydalanilmoqda. Ular barcha yuqori organizmlarning genomlarida ham uchraydi.

SSR lokuslari polimorfizmi yordamida bir qator ilmiy ishlar olib borildi: o'rganilgan soya namunalarini aniqlash 100 genotip guruhida topilgan 26 SSR mintaqalari tufayli juda aniqlik bilan amalga oshirildi; makkajo'xori (lot. "Zea mays L."), guruch (lat. "Oryza sativa L."),

arpa (lotincha "Hordeum vulgare L."), soya (lotincha "Glycine max L."), arabidopsis (lotincha "Arabidopsis thaliana") va boshqalar; batafsil molekulyar genetik xaritalarni tuzishda, genetik xilma-xillikni baholash va Malus (olma daraxti) va Pirus (nok) turlarining o'simliklarini, genetik xilma-xillikni baholash va navlarini DNK sertifikatlash bo'yicha ilmiy tadqiqotlarga hissa qo'shdi.

Afzalliklar kompleksi tufayli SSR markerlari ((mikrosatellitlar) inglizcha oddiy ketma-ketlikni takrorlash - oddiy takrorlanadigan ketma-ketliklar) eng istiqbolli va tadqiqot uchun mos bo'lganlardan biri hisoblanadi. SSR markerlarining ijobiy xususiyatlari qatoriga quyidagilar kiradi: boshqa genetik markerlardan farqli o'laroq nisbatan oson aniqlanadigan, juda polimorf, genom bo'ylab hamma joyda yuqori aniqlik, ishonchlilik, natijalarning yaxshi takrorlanishi, ushbu lokusda heterozigotlarni aniqlashda amaliylik.

Shu bilan birga, SSR markerlarining kamchiliklari ham bor: o'ziga xos primerlarni tanlash uchun genomning nukleotidlar ketma-ketliklari to'g'risida ma'lumotga ega bo'lish kerak; usulning yuqori narxi (kuchaytirish zarurati, DNKning ixtiyoriy qismlarida nukleotidlar ketma-ketligini aniqlash, mikrosatellit takrorlanishlarini aniqlash va u yoki bu primerni qurishda o'rganilayotgan lokus genomining yonbosh qismlarini aniqlash).

- RAPD (Tasodifiy kuchaytirilgan polimorfik DNK) [19] - bu birinchi molekulyar usullardan biri, bu oz sonli tasodifiy nukleotidlarni (10 ga yaqin) o'z ichiga olgan bitta primer yordamida DNK fragmentlarini PCR (kuchaytirish). Ushbu usulni faol qo'llash 20-asrning oxirida boshlandi: somaklonlar orasida polimorfizmni baholash; bitta o'simlik turidagi intervalial farqlashni aniqlash (madaniy zig'ir - lat. "Línum usitatíssimum", ìrísí - lat. "Iris", kalamus yoki rattan - lat. "Calamus", tsitrus - lat. "tsitrus", manjet - lat. " Alchemilla ") va navlarning farqlari va boshqalar.

Bundan tashqari, RAPD usuli asosida qarag'ay va qoraqarag'aylarning genetik xilma-xilligi aniqlandi, ba'zi o'simlik turlari uchun genetik xaritalar qurildi va hokazo.

Tasodifiy ravishda kuchaytirilgan polimorf DNKning afzalliklari uning soddaligi, arzonligi, tezligi, nukleotidlar ketma-ketligini bilish talab qilinmaydi, bu DNK genomining polimorfizmi uchun ekspres usul.

Bugungi kunga kelib, RAPD usulidan foydalanish bir qator kamchiliklar tufayli kamaydi: dominant meros turi, bu tahlilning aniqligini pasaytiradi, chunki heterozigot holatini homozigot holatidan ajratish mumkin emas; reaktsiya sharoitidagi o'zgarishlarning beqarorligi, natijada natijalarning takrorlanuvchanligi pasayadi; sekin sur'at xatolarni keltirib chiqaradigan tavlanish jadvali.

- CAPS (Cleaved Amplified Polimorphic Sequences - cleaved amplified polimorphic sequences) [19] - hozirgi kunga qadar umuman CAPS markerlarini, ularning faoliyat printsipini, ishlash uslubining xususiyatlarini va qo'llash sohasini o'rganish bo'yicha ko'plab tadqiqotlar o'tkazildi. . CAPS markerlaridan foydalanishni boshlagan birinchi ilmiy ishlardan biri Arabidopsisda ushbu markerlardan foydalanishga asoslangan ilmiy tadqiqotlarni tavsiflovchi nashr edi. Molekulyar markerlardan foydalanishning asosiy yo'nalishlari quyidagilardir: viruslar va kasalliklarga, gerbitsidlarga chidamliligi uchun javob beradigan genetik lokuslarning polimorfizmini izlash; genetik xaritalash; genlarning tuzilishini, funktsiyasini, ifodalanishini va boshqarilishini o'rganish; QTLning lokalizatsiyasi (miqdoriy xususiyatlar soni - miqdoriy belgilarning joylashuvi).

CAPS uslubining ishlash printsipi quyidagi bosqichlardan o'tishdan iborat:

• sinov materialidan DNKni ajratish;

• ma'lum bir primer yordamida PCR tahlil qilish;

• restlikatsion endonukleazalar yordamida amplikonning gidrolizi;

• tegishli gelda elektroforez bilan DNK qismlarini ajratish [3, 20].

Shuningdek, CAPS usulini PCR usulining RFLP usuli bilan birikmasi deb ta'riflash mumkin, faqat bitta farq shundaki, bu usulda butun genom o'rniga DNKning kichik qismini PCR kuchaytirishi qo'llaniladi.

Shuni ta'kidlash kerakki, ushbu usul uni qo'llash sohasida ijobiy va salbiy tomonlarga ega.

Ijobiy bo'lganlar orasida quyidagilar mavjud: merosning kodominant turi; foydalanish qulayligi; o'simlik oilasidan qat'iy nazar o'simlik etishtirishda CAPS markerlarining yuqori samaradorligi.

Usulning kamchiliklariga quyidagilar kiradi: mikrosatellit markerlarga nisbatan kamroq polimorf; usulning yuqori narxi.

- AFLP (kuchaytirilgan fragment uzunligi polimorfizmi) - kuchaytirilgan fragment uzunligi polimorfizmi XX asrda rivojlangan. AFLP tahlili uch bosqichda amalga oshiriladi:

• genomik DNKning ikkita restriktiv ferment bilan cheklanishi;

• restratsiya mahsulotlarini (genomik DNK) adapter bilan bog'lash (DNK molekulalarini DNK ligaza fermentlari yordamida tikish);

• olingan parchalarni astar yordamida kuchaytirish.

AFLP usulini qo'llashning birinchi yo'nalishlaridan biri bu DNK barmoq izlari (inglizcha barmoq - barmoq va bosma - bosib chiqarish, "barmoq izlari") [21, 22]. Keyinchalik AFLP tahlillari asosida Capsicum annuum L. (paprika), Solanum tuberosum L. (kartoshka), Brassica napus L kabi o'simliklarning iqtisodiy jihatdan qimmatli xususiyatlari bilan bog'liq bo'lgan joylarni belgilash bo'yicha bir qator ilmiy tadqiqotlar o'tkazildi. (kolza), Salix alba L. (majnuntol) populyatsiyasi genetikasini o'rganish bo'yicha, Zéa máys (makkajo'xori) va Glycine max (soya) da genetik xilma-xillikni o'rnatish. Shuningdek, ushbu tahlil usuli o'z-o'ziga xos o'zgaruvchanlikni baholash va o'rganish uchun, genomik xaritalash, qishloq xo'jaligi o'simliklarining turli navlari va qatorlarida genetik polimorfizmlarni aniqlash va boshqalar uchun ishlatiladi.

AFLP usuli ishonchlilik, barqarorlik, usulning yaxshi takrorlanishi, zotlar va yaqin turlar o'rtasidagi munosabatni baholashda yuqori ma'lumotli tarkib kabi ijobiy fazilatlar tufayli keng tarqaldi, oldindan klonlash va DNK sekvensiyasini talab qilmaydi, bilishni talab qilmaydi. asosiy ketma-ketlik va o'ziga xos primerlar va boshqalar ...

Shuningdek, ushbu usul ijobiy fazilatlardan tashqari, salbiy tomonlarga ham ega:

merosning dominant turi, usuli juda murakkab, qimmat, sekin va noaniq.