Tahlilni xromatografik usullari, tasnifi va sifat tahlilda qo`llanishi

Qo'llash sohasi

Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi “Identifikatsiya”, “Chet el aralashmalari”, “Eritish”, “Dozalashning bir xilligi”, “Miqdoriy aniqlash” sinovlarida dori vositalarining ham sifat, ham miqdoriy tahlili uchun muvaffaqiyatli qo‘llaniladi. Shuni ta'kidlash kerakki, xromatografiya bir namunada bir nechta testlarni, jumladan "Identifikatsiya" va "Miqdoriy aniqlash" ni birlashtirish imkonini beradi.

Uskunalar

Tahlil qilish uchun tegishli asboblar - suyuq xromatograflar qo'llaniladi.
Suyuq xromatografning tarkibi odatda quyidagi asosiy komponentlarni o'z ichiga oladi:
- mobil fazani tayyorlash qurilmasi, shu jumladan mobil fazali konteyner (yoki mobil fazaning bir qismi bo'lgan alohida erituvchilar bo'lgan idishlar) va mobil fazani gazsizlantirish tizimi;
- nasos tizimi;
– mobil fazali mikser (agar kerak bo'lsa);
– namuna quyish tizimi (injektor), qo‘lda yoki avtomatik (avtonamuna oluvchi) bo‘lishi mumkin;
— xromatografik ustun (termostatga o'rnatilishi mumkin);
— detektor (turli aniqlash usullari bilan bir yoki bir nechta);
— xromatografni boshqarish tizimi, maʼlumotlarni yigʻish va qayta ishlash.
Bundan tashqari, xromatograf quyidagilarni o'z ichiga olishi mumkin: namuna tayyorlash tizimi va ustundan oldingi reaktor, ustunni almashtirish tizimi, ustundan keyingi reaktor va boshqa jihozlar.

Nasos tizimi

Nasoslar mobil fazani ustunga oldindan belgilangan tezlikda etkazib beradi. Mobil fazaning tarkibi va oqim tezligi tahlil paytida doimiy bo'lishi yoki o'zgarishi mumkin. Mobil fazaning doimiy tarkibi bo'lsa, jarayon izokratik, ikkinchisida - gradient deb ataladi. Zamonaviy suyuq xromatograf nasos tizimi bir yoki bir nechta kompyuter tomonidan boshqariladigan nasoslardan iborat. Bu gradient elyusiyasi paytida ma'lum bir dasturga muvofiq mobil fazaning tarkibini o'zgartirishga imkon beradi. Analitik yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi uchun nasoslar kolonnaga harakatlanuvchi fazaning oqim tezligini 40 MPa gacha bo'lgan ustun kirish bosimida 0,1 dan 10 ml / min oralig'ida saqlashga imkon beradi. Bosim pulsatsiyalari nasoslarning dizayniga kiritilgan maxsus damper tizimlari tomonidan minimallashtiriladi. Nasoslarning ishchi qismlari korroziyaga chidamli materiallardan tayyorlanadi, bu esa mobil faza tarkibida agressiv komponentlardan foydalanish imkonini beradi.

Musluklar

Mikserda, agar zarur aralashma oldindan tayyorlanmagan bo'lsa, nasoslar tomonidan etkazib beriladigan alohida erituvchilardan bitta mobil faza hosil bo'ladi. Mikserdagi mobil faza komponentlarini aralashtirish ham past bosimda (nasoslardan oldin) va yuqori bosimda (nasoslardan keyin) amalga oshirilishi mumkin. Mikser mobil fazani tayyorlash va izokratik elutsiya uchun ishlatilishi mumkin.
Mikserning hajmi gradient elyusiyasidagi tarkibiy qismlarni ushlab turish vaqtiga ta'sir qilishi mumkin.

Injektorlar

Injektorlar AOK qilingan namunaning hajmini o'zgartirish qobiliyatiga ega universal yoki faqat ma'lum hajmdagi namunani kiritish uchun diskret bo'lishi mumkin. Ikkala turdagi injektorlar ham avtomatik bo'lishi mumkin ("avto-injektorlar" yoki "avto-namuna"). Namuna injektori (eritma) to'g'ridan-to'g'ri xromatografik ustunning oldida joylashgan. Injektorning dizayni mobil fazaning oqim yo'nalishini o'zgartirishga va namunani ma'lum hajmdagi dozalash halqasiga (odatda 10 dan 100 mkl gacha) yoki maxsus o'zgaruvchan hajmli dozalash moslamasiga oldindan kiritish imkonini beradi. Loopning hajmi uning belgisida ko'rsatilgan. Diskret injektorning dizayni, qoida tariqasida, pastadirni almashtirishga imkon beradi. Zamonaviy avtomatik injektorlar bir qator qo'shimcha funktsiyalarga ega bo'lishi mumkin, masalan, ular namuna tayyorlash stantsiyasi bo'lib xizmat qilishi mumkin: namunalarni aralashtirish va suyultirish va ustundan oldin derivatizatsiya reaktsiyasini amalga oshirish.

Xromatografiya ustuni

Xromatografik ustunlar odatda zanglamaydigan po'lat, shisha yoki sorbent bilan to'ldirilgan va har ikki tomondan 2-5 mkm gacha bo'lgan teshik diametri bo'lgan filtrlar bilan yopilgan plastik quvurlardir. Analitik ustunning uzunligi 5 dan 60 sm gacha yoki undan ko'p bo'lishi mumkin, ichki diametri 2 dan 10 mm gacha. Mikrokolonkali xromatografiyada ichki diametri 2 mm dan kam bo'lgan ustunlar qo'llaniladi. Ichki diametri taxminan 0,3-0,7 mm bo'lgan kapillyar ustunlar ham mavjud. Preparativ xromatografiya uchun ustunlar ichki diametri 50 mm va undan ortiq bo'lishi mumkin.
Analitik ustundan oldin turli xil yordamchi funktsiyalarni bajaradigan qisqa ustunlar (oldindan ustunlar) o'rnatilishi mumkin, ularning asosiysi analitik ustunni himoya qilishdir. Odatda, tahlil xona haroratida amalga oshiriladi, ammo ajratish samaradorligini oshirish va tahlil qilish muddatini qisqartirish uchun 80-100 ° S gacha bo'lgan haroratlarda ustunlarni termostatni qo'llash mumkin. Ajratish paytida yuqori haroratdan foydalanish imkoniyati statsionar fazaning barqarorligi bilan cheklangan, chunki uni yo'q qilish yuqori haroratlarda mumkin.

Statsionar faza (sorbent)

Ko'p ishlatiladigan sorbentlar:

• 
  silikagel, alumina oddiy fazali xromatografiyada ishlatiladi. Bu holatda ushlab turish mexanizmi odatda adsorbsiya hisoblanadi;
  
• 
  silika jeli, qatronlar yoki payvandlangan kislotali yoki asosiy guruhlarga ega polimerlar. Qo'llash sohasi - ion almashinuvi va ion xromatografiyasi;
  
• 
  silika jeli yoki ma'lum bir gözenek hajmi taqsimotiga ega polimerlar (o'lchamni istisno qilish xromatografiyasi);
  
• 
  kimyoviy modifikatsiyalangan sorbentlar (bog'langan fazali sorbentlar), ko'pincha silikagel asosida tayyorlanadi. Saqlash mexanizmi mobil va statsionar fazalar o'rtasida adsorbsiya yoki tarqatishdir. Ko'lami payvand qilingan funktsional guruhlarning turiga bog'liq. Ayrim turdagi sorbentlardan ham teskari, ham normal fazali xromatografiyada foydalanish mumkin;
  
• 
  kimyoviy modifikatsiyalangan chiral sorbentlar, masalan, tsellyuloza va amiloza hosilalari, oqsillar va peptidlar, siklodekstrinlar, enantiomerlarni ajratish uchun ishlatiladigan xitozanlar (xiral xromatografiya).
  

Bog'langan fazali sorbentlar turli darajadagi kimyoviy modifikatsiyaga ega bo'lishi mumkin. Eng ko'p ishlatiladigan bog'langan fazalar:
– oktadesil guruhlari (sorbent oktadesilsilan (ODS) yoki C 18);
– oktil guruhlari (sorbent oktilsilan yoki C 8);
– fenil guruhlari (fenilsilan sorbent);
– siyanopropil guruhlari (CN sorbent);
- aminopropil guruhlari (NH 2 sorbent);
– diol guruhlari (sorbent diol).
Ko'pincha, tahlil C 18 sorbent yordamida teskari faza rejimida polar bo'lmagan bog'langan fazalarda amalga oshiriladi.
Silikagel asosidagi bog'langan fazali sorbentlar, agar ishlab chiqaruvchi tomonidan boshqacha qoida nazarda tutilgan bo'lmasa, pH 2,0 dan 7,0 gacha bo'lgan qiymatlarda kimyoviy jihatdan barqarordir. Sorbent zarralari sharsimon yoki tartibsiz shaklga ega va turli xil g'ovaklikka ega bo'lishi mumkin. Analitik yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasida sorbentning zarracha hajmi odatda 3-10 mkm, preparativ yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasida 50 mkm yoki undan ko'p bo'ladi. Bundan tashqari, sorbent ustunning butun hajmini to'ldiradigan teshiklari bo'lgan monolit bo'lgan monolit ustunlar mavjud.
Ajratishning yuqori samaradorligi sorbent zarralarining yuqori sirt maydoni (bu ularning mikroskopik o'lchamlari va gözeneklerin mavjudligi natijasidir), shuningdek sorbent tarkibining bir xilligi va uning zich va bir xil qadoqlanishi bilan ta'minlanadi.

Detektorlar

Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasida turli xil aniqlash usullari qo'llaniladi. Umumiy holda, xromatografik ustundan so'ng, unda erigan komponentlar bilan harakatlanuvchi faza detektor hujayraga kiradi, bu erda uning u yoki bu xususiyatlari doimiy ravishda o'lchanadi (spektrning ultrabinafsha yoki ko'rinadigan hududida yutilish, floresans, sinishi. indeks, elektr o'tkazuvchanligi va boshqalar). Olingan xromatogramma mobil fazaning ba'zi fizik yoki fizik-kimyoviy parametrlarining vaqtga bog'liqligi grafigi hisoblanadi.
Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasida eng keng tarqalgan detektorlar spektrofotometrikdir. Maxsus mo'ljallangan mikroelementdagi moddalarni elyusiya qilish jarayonida elyuatning optik zichligi oldindan tanlangan to'lqin uzunligida o'lchanadi. Detektorning chiziqliligining keng diapazoni ham aralashmalarni, ham aralashmaning asosiy tarkibiy qismlarini bitta xromatogrammada tahlil qilish imkonini beradi. Spektrofotometrik detektor o'zining ish diapazonidagi (odatda 190-600 nm) har qanday to'lqin uzunligida aniqlash imkonini beradi. Bir vaqtning o'zida bir nechta to'lqin uzunliklarida aniqlash imkonini beruvchi ko'p to'lqinli detektorlar va butun ish to'lqin uzunligi diapazonida (odatda 190-950 nm) bir vaqtning o'zida optik zichlikni qayd etish imkonini beruvchi diodli massiv detektorlari ham qo'llaniladi. Bu detektor hujayradan o'tuvchi komponentlarning yutilish spektrlarini qayd etish imkonini beradi.
Flüorimetrik detektor floresan birikmalar yoki floresan hosil bo'lmagan birikmalarni ularning floresan hosilalari shaklida aniqlash uchun ishlatiladi. Ftorimetrik detektorning ishlash printsipi so'rilgan yorug'likning lyuminestsent emissiyasini o'lchashga asoslangan. Absorbsiya odatda spektrning ultrabinafsha mintaqasida amalga oshiriladi, floresan nurlanishning to'lqin uzunliklari so'rilgan nurning to'lqin uzunliklaridan oshadi. Fluorometrik detektorlar juda yuqori sezuvchanlik va selektivlikka ega. Floresan detektorlarining sezgirligi spektrofotometriklarga qaraganda taxminan 1000 baravar yuqori. Zamonaviy lyuminestsent detektorlar nafaqat xromatogrammalarni olish, balki tahlil qilinadigan birikmalarning qo'zg'alish va floresans spektrlarini qayd etish imkonini beradi.
Spektrning ultrabinafsha va ko'rinadigan hududlarida (masalan, uglevodlar) zaif so'rilgan birikmalarni aniqlash uchun foydalaning. refraktometrik detektorlar (refraktometrlar). Ushbu detektorlarning kamchiliklari past (spektrofotometrik detektorlarga nisbatan) sezgirligi va signal intensivligining sezilarli haroratga bog'liqligi (detektor termostatlangan bo'lishi kerak), shuningdek, ularni gradient elutsiya rejimida ishlatishning mumkin emasligi.
Ish printsipi evaporativ lazer nurlarining tarqalish detektorlari harakatlanuvchi fazani tashkil etuvchi xromatografik erituvchilar va tahlil qilinadigan moddalarning bug‘ bosimidagi farqga asoslanadi. Ustun chiqishidagi mobil faza nebulizerga kiritiladi, azot yoki CO 2 bilan aralashtiriladi va nozik dispersli aerozol shaklida 30-160 ° S haroratli isitiladigan evaporatator trubasiga kiradi, unda mobil faza bug'lanadi. Tahlil qilinadigan moddalarning uchuvchan bo'lmagan zarralari aerozollari dispersiya kamerasida yorug'lik oqimini tarqatadi. Yorug'lik oqimining tarqalish darajasiga qarab, aniqlangan birikma miqdorini aniqlash mumkin. Detektor refraktometrikga qaraganda sezgirroq, uning signali namunaning optik xususiyatlariga, tahlil qiluvchi moddalardagi funktsional guruhlarning turiga, mobil faza tarkibiga bog'liq emas va gradient elyusiya rejimida ishlatilishi mumkin. .
Elektrokimyoviy detektorlar (konduktometrik, amperometrik, kulometrik va boshqalar). Amperometrik detektor qattiq elektrod yuzasida oksidlanishi yoki kamayishi mumkin bo'lgan elektroaktiv birikmalarni aniqlash uchun ishlatiladi. Analitik signal - oksidlanish yoki qaytarilish oqimining kattaligi. Detektor xujayrasi kamida ikkita elektrodga ega - ishchi elektrod va mos yozuvlar elektrod (kumush xlorid yoki po'lat). Elektrodlarga ish potentsiali qo'llaniladi, uning qiymati aniqlanayotgan birikmalarning tabiatiga bog'liq. O'lchovlar doimiy potentsialda ham, impulsli rejimda ham, bitta signalni yozish davri davomida ishchi elektrod potentsialining o'zgarishi profili o'rnatilganda amalga oshirilishi mumkin. Amperometrik detektor uglerod materiallaridan (ko'pincha shishasimon uglerod yoki grafit) va metalldan: platina, oltin, mis, nikeldan tayyorlangan ishchi elektrodlardan foydalanadi.
Ion xromatografiyasida anion va kationlarni aniqlash uchun konduktometrik detektor ishlatiladi. Uning ishlash printsipi moddaning elutsiyasi paytida mobil fazaning elektr o'tkazuvchanligini o'lchashga asoslangan.
Mass-spektrometrik detektor juda informatsion bo'lib, u yuqori sezuvchanlik va selektivlikka ega. Suyuq xromatografiya uchun massa spektrometrlarining so'nggi modellari 20 dan 4000 amu gacha bo'lgan m / z massa oralig'ida ishlaydi.
Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi Furye-IR detektorlari, radioaktivlik va boshqalardan ham foydalanadi.

Ma'lumotlarni yig'ish va qayta ishlash tizimi

Zamonaviy ma'lumotlarni qayta ishlash tizimi o'rnatilgan xromatografga ulangan shaxsiy kompyuterdir dasturiy ta'minot, bu sizga xromatogrammani ro'yxatdan o'tkazish va qayta ishlash, shuningdek, xromatografning ishlashini nazorat qilish va xromatografik tizimning asosiy parametrlarini kuzatish imkonini beradi.

mobil faza

Yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasida harakatlanuvchi faza ikki tomonlama funktsiyani bajaradi: u desorbsiyalangan molekulalarning ustun bo'ylab o'tkazilishini ta'minlaydi va muvozanat konstantalarini tartibga soladi va natijada statsionar faza bilan o'zaro ta'sir qilish natijasida ushlab turadi (sirtda sorblanadi). ) va ajratilayotgan moddalarning molekulalari bilan. Shunday qilib, yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasida harakatlanuvchi faza tarkibini o'zgartirish orqali birikmalarning saqlanish vaqtlariga, ularni ajratishning selektivligi va samaradorligiga ta'sir ko'rsatish mumkin.
Mobil faza bitta erituvchidan iborat bo'lishi mumkin, ko'pincha ikkita, agar kerak bo'lsa, uch yoki undan ko'p. Mobil fazaning tarkibi uning tarkibidagi erituvchilarning hajm nisbati sifatida ko'rsatilgan. Ba'zi hollarda, maxsus belgilanishi kerak bo'lgan massa nisbati ko'rsatilishi mumkin. Mobil fazaning komponentlari sifatida ma'lum bir pH qiymatiga ega bufer eritmalar, turli tuzlar, kislotalar va asoslar va boshqa modifikatorlardan foydalanish mumkin.
Oddiy fazali xromatografiyada odatda suyuq uglevodorodlar (geksan, siklogeksan, geptan) va boshqa nisbatan qutb bo'lmagan erituvchilar, mobil fazaning elutsiya kuchini boshqaradigan qutbli organik birikmalarning kichik qo'shilishi bilan ishlatiladi.
Teskari fazali xromatografiyada harakatlanuvchi faza sifatida suv yoki suvli-organik aralashmalardan foydalaniladi. Organik qo'shimchalar odatda qutbli organik erituvchilardir (asetonitril va metanol). Ajratishni optimallashtirish uchun ma'lum bir pH qiymatiga ega bo'lgan suvli eritmalar, xususan, bufer eritmalari, shuningdek, mobil fazaga turli qo'shimchalar qo'llanilishi mumkin: kislotali birikmalarni ajratishda fosforik va sirka kislotalari; asosiy birikmalarni ajratishda ammiak va alifatik aminlar va boshqa modifikatorlar.
Ko'chma fazaning tozaligi xromatografik tahlilga katta ta'sir qiladi, shuning uchun suyuq xromatografiya uchun maxsus ajratilgan erituvchilardan (shu jumladan, suv) foydalanish afzalroqdir.
UV spektrofotometrik detektordan foydalanganda, mobil faza aniqlash uchun tanlangan to'lqin uzunligida aniq yutilishga ega bo'lmasligi kerak. Muayyan ishlab chiqaruvchining hal qiluvchi ma'lum bir to'lqin uzunligida shaffoflik yoki optik zichlik chegarasi ko'pincha qadoqda ko'rsatilgan.
Mobil faza va tahlil qilingan eritmalar erimagan zarrachalar va gaz pufakchalaridan xoli bo'lishi kerak. Qabul qilingan suv laboratoriya sharoitlari, suvli eritmalar, avval suv bilan aralashtirilgan organik erituvchilar, shuningdek, tahlil qilingan eritmalar nozik filtrlash va gazsizlantirishga duchor bo'lishi kerak. Ushbu maqsadlar uchun odatda ma'lum bir erituvchi yoki eritmaga nisbatan inert bo'lgan 0,45 mkm bo'lgan teshik o'lchamli membrana filtri orqali vakuumli filtrlash qo'llaniladi.

Belgilanishi kerak bo'lgan xromatografik shartlar ro'yxati

Monografiya quyidagilarni o'z ichiga olishi kerak: ishlab chiqaruvchi va katalog raqamini ko'rsatgan holda ustunning to'liq tijorat nomi, ustun o'lchamlari (uzunligi va ichki diametri), zarrachalar hajmini, gözenek hajmini, ustun haroratini ko'rsatadigan sorbent turi (agar haroratni nazorat qilish zarur bo'lsa). , AOK qilingan namunaning hajmi (hajm o'tkazgichlari), mobil faza tarkibi va uni tayyorlash usuli, mobil fazaning besleme tezligi, detektor turi va aniqlash shartlari (agar kerak bo'lsa, ishlatiladigan detektor hujayrasining parametrlari), gradient rejimining tavsifi (agar ishlatilgan), shu jumladan dastlabki sharoitlarga qayta muvozanatlash bosqichi, xromatografiya vaqti, batafsil tavsif usullari va hisoblash formulalari, standart va sinov eritmalarini tayyorlash tavsiflari.
Agar avtonamuna oluvchida ustundan oldingi derivatizatsiya ishlatilsa, avtomatik namuna olish dasturi haqida ma'lumot beriladi. Ustunlardan keyingi derivatizatsiyadan foydalanilganda, derivatizatsiya reagentining oziqlanish tezligi, aralashtirish halqasining hajmi va uning harorati ko'rsatilgan.