Сборник содержит материалы научной мультиконференции «Биотех- нология медицине будущего»

Рекомбинантный фермент Cpf из бактерии 
Moraxella bovis
Васиховская В.А.
1
, Романенко М.В.
1
, Гончар Д.А.
2
, Нетёсов С.В.
1
1
Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия 
2
ООО СибЭнзайм, Новосибирск, Россия
Белок Cpf1 является компонентом системы CRISPR/Cas V типа и представляет собой 
адресуемую эндонуклеазу, используемую прокариотами для расщепления инвазивной 
ДНК. Использование компонентов системы CRISPR в клетках эукариот дает возмож-
ность с высокой точностью совершать такие генно-инженерные манипуляции как 
редактирование генома по пути гомологичной рекомбинации, нокаут генов по пути 
NHEJ, регуляция экспрессия генов и в перспективе применять их в терапевтических 
целях. Получение и изучение новых ферментов, таких как Cpf1, позволит расширить 
инструментарий для этих видов работ и поэтому представляет перспективную биотех-
нологическую задачу.
Целью данной работы являлось обнаружение гена 
cpf1
в геноме бактерий рода 
Moraxella
с последующим клонированием и экспрессией гена, выделением очищенного 
препарата Cpf1 и тестированием его активности.
На начальном этапе был проведен поиск последовательностей геномов для 
различных штаммов бактерий рода 
Moraxella 
в базе данных GenBank, среди них были 
отобраны и выровнены последовательности генов 
cpf1
. На консервативный районы 
были подобраны праймеры для амплификации целевого гена. Последовательность 
начала и конца гена 
cpf1 
была установлена методом прогулки по хромосоме, основанном 
на эффекте супрессии ПЦР, для гена из штамма 
Moraxella bovis
, его полная нуклео-
тидная последовательность была установлена секвенированием по Сэнгеру. Целевой 
ген был клонирован в составе экспрессирующего вектора pET15b по методу гомоло-
гичной рекомбинации при помощи системы In-Fusion. В полученной конструкции ген 
сцеплен с последовательностью, кодирующей гистидиновый олигопептид на N-конце 
белка. При поддержке компании «СибЭнзайм» был осуществлен подбор условий для 
экспрессии гена и очистка целевого белка при помощи ВЭЖХ.
Тестирование полученного препарата 
in vitro
показало, что фермент Cpf1, несмотря 
на наличие гистидинового олигопептида, проявляет эндонуклеазную активность, 
причем полнота протекания гидролиза ДНК максимальна в буферном растворе
с C
NaCl
= 100 мМ, а pH в диапазоне 7,0–8,5 не влияет на степень конверсии. Также бы- 
ло установлено, что наличие в модельной ДНК последовательности TTTN в качестве 
PAM-сайта достаточно для эффективного протекания гидролиза.
Таким образом, был выделен препарат белка Cpf1 с доказанной эндонуклеазной 
активностью 
in vitro
. Узнавание ферментом T-богатого PAM-сайта позволит расширить 
набор мишеней для геномного редактирования. Дальнейшее изучение свойств пре- 
парата и сравнение с коммерчески доступными препаратами Cpf1 из бактерий 
Acidaminococcus
и 
Lachnospiraceae
позволит усовершенствовать инструментарий для 
генно-инженерных манипуляций.
Авторы выражают благодарность коллективу компании «СибЭнзайм» за помощь
в проведении экспериментов. Исследование было поддержано программой «УМНИК-2018».

---

Всероссийская мультиконференция с международным участием «Биотехнология – медицине будущего»
29 июня - 2 июля 2019 г., г. Новосибирск, Россия
156