Rasm Turli dnk molekulalari orasidagi gibridlanish

G-C > DA> G G> G T ≥ G A> T T ≥ A A> T C ≥ A C ≥ C C
Guanidin G eng "fotoshchi" asosdir, chunki u kuchli tayanch juftlarini hosil qiladi va bir-birini to'ldirmaydi (G · G, G · T va G · A). Boshqa tomondan, sitozin C eng kamsituvchi asosdir, chunki u eng barqaror to'ldiruvchi juftlarni va qo'shimcha bo'lmagan asoslar (T · C ≥ A · C ≥ C · C) bilan beqaror juftlarni hosil qiladi.
Havolalar
Shuningdek qarang

• 
  PrimerDigital: Onlayn PCR asboblari va oligonukleotid tahlili
  
• 
  

Virusli yoki bakterial DNK eritmalari asta-sekin qizdirilsa, ularning molekulalari ma'lum bir haroratda denaturatsiyaga uchraydi (27-16-rasm). Nativ DNK dupleksidan bo'shashgan denatüratsiyalangan shaklga o'tish ultrabinafsha nurlarning yutilishining ortishi yoki DNK eritmasining yopishqoqligining pasayishi bilan aniqlanishi mumkin. Har bir DNK turi o'ziga xos denaturatsiya harorati bilan tavsiflanadi, bu "erish nuqtasi" deb ataladi. DNKdagi G = C juftlarining tarkibi qanchalik yuqori bo'lsa, bu DNKning erish nuqtasi shunchalik yuqori bo'ladi. Buning sababi shundaki, GC bug'lari barqarorroq va ularning dissotsiatsiyasi uchun A = T juftlarini yo'q qilishdan ko'ra ko'proq energiya talab qilinadi; Bu qisman G = C juftlari uchta vodorod aloqasi bilan bog'langanligi va A = T juftliklari faqat ikkitasi bilan bog'liq.
DNK preparatining erish nuqtasini qat'iy pH va ion kuchi sharoitida ehtiyotkorlik bilan aniqlash DNKdagi A = T va G = C juftliklari o'rtasidagi munosabatlar haqida ma'lumot berishi mumkin.
G = C va A = T juftlarining nisbati tufayli DNKning ikkinchi fizik xossasi suzuvchi zichlikdir. Yuqori G = C-nap tarkibiga ega bo'lgan DNK preparati yuqori A = T-juft tarkibiga ega bo'lgan DNKga qaraganda bir oz yuqoriroq zichlikka ega. DNK preparatlari zichligi DNK zichligi bilan bir xil diapazonda joylashgan seziy xloridning konsentrlangan eritmasida yuqori tezlikda santrifüj qilinadi.
Guruch. 27-15. Gibridlanish testining printsipi. Har xil turdagi organizmlardan ajratilgan DNKning ikkita preparati isitiladi, shunda ular butunlay denatüratsiya qilinadi va ularning zanjirlari ajralib chiqadi. Ushbu dorilar aralashtirilganda va asta-sekin sovutilganda, har bir turning qo'shimcha DNK zanjirlari bir-birini topadi va normal duplekslarni hosil qilish uchun tavlanadi. Ikki DNK o'rtasida muhim ketma-ketlik homologiyasi mavjud bo'lsa, qisman duplekslar bo'lgan gibrid molekulalarning shakllanishi mumkin. Gomologiya darajasi qanchalik yuqori bo'lsa, duragaylarni hosil qilish ehtimoli shunchalik yuqori bo'ladi. Aralashmadagi duragaylarning tarkibini turli usullar bilan, xususan, xromatografiya yoki zichlik gradienti sentrifugalash orqali o'lchash mumkin. Odatda, o'lchash jarayonini soddalashtirish uchun DNKdan biri radioaktiv izotop bilan etiketlanadi.

Guruch. 27-16. Ikki DNK preparatining denaturatsiya (erish) egri chizig'i. O'tishning o'rta nuqtasiga mos keladigan harorat erish nuqtasi deb ataladi. Qiymat pH va tuz konsentratsiyasiga bog'liq bo'lganligi sababli, har doim uni o'lchash shartlarini ko'rsatish kerak.

Santrifüj trubkasida santrifüj qilinganda, trubaning pastki qismida eng yuqori zichlikka ega bo'lgan zichlik gradienti hosil bo'ladi. Agar siz unga DNK qo'ysangiz, u avvalo probirkaning pastki qismiga qarab harakat qiladi, lekin keyin u ma'lum bir holatda to'xtaydi va suvda qoladi. Bu holatda u na suzib, na joylasha oladi, chunki bu erda eritmaning zichligi uning zichligiga teng. Ushbu usuldan foydalanib, Ch.da batafsil tavsiflangan. 28, bir-biridan G = C-juftlari tarkibiga ko'ra farq qiluvchi DNK molekulalarini ajratish mumkin, chunki ular turli xil suzuvchi zichlikka ega. Berilgan DNKning suzuvchi zichligiga asoslanib, undagi G = C va A = T juftlarining nisbatini hisoblash mumkin.
. Denaturatsiya
DNK denaturatsiyasi kimyoviy omillar (karbamid, guanidin xlorid, kislota, ishqor) va fizik omillar (harorat) ta'sirida amalga oshiriladi. Denaturatsiya natijasida DNKning ikkilamchi strukturasi buzilishi sodir bo'ladi. Denaturatsiya qiluvchi omilning ta'siri yo'qolganda, DNKning ikkilamchi tuzilishi tiklanishi kerak. Bu jarayon renaturatsiya deyiladi
DNKning denaturatsiyasi yoki erishi 260 nm to'lqin uzunligida DNK eritmalarining optik zichligi oshishi bilan birga keladi. Bu hodisa giperxrom effekti deb ataladi. Belgilangan to'lqin uzunligida mononukleotidlarga to'liq parchalanishi bilan DNK eritmasining optik zichligidagi maksimal o'sish taxminan 80% ni tashkil qiladi.
Faqat poli-d (AT) dan tashkil topgan DNK molekulasi poli-d (HC) dan tashkil topgan DNK molekulasiga qaraganda pastroq haroratlarda eriydi. Buning sababi shundaki, A va T o'rtasida ikkita vodorod bog'i, G va C o'rtasida uchta vodorod bog'i hosil bo'ladi.
2. Erish nuqtasi
DNKning eng muhim xarakteristikasi uning erish nuqtasi bo'lib, u DNK eritmasining optik zichligi oshishi DNKning to'liq denaturatsiyasi bilan kuzatiladigan maksimal o'sishning yarmiga teng bo'lgan haroratga to'g'ri keladi. Poli-d (AT) dan tashkil topgan DNK ning erish harorati 66 ° C, poli-d (HC) dan iborat DNK 85 ° C. Tabiiy DNKning erish nuqtasi 66 ° C dan yuqori, lekin 85 ° dan kam. C. chunki ular barcha toʻrtta azotli asoslarni oʻz ichiga oladi, lekin turli tirik organizmlar uchun har xil nisbatda. Shunday qilib, inson DNKsi 81 - 82 o C, E. coli - 90,5 o C ga teng erish nuqtasi bilan tavsiflanadi.
DNK eritmasi sovutilganda (tavlanganda) asl ikkilamchi DNK strukturasi komplementarlik tamoyiliga muvofiq tiklanishi mumkin.
3. Gibridlanish
Agar turli DNK molekulalarining aralashmasi dastlab eritilib, keyin tavlansa, DNK molekulalari o'rtasida ularning birlamchi tuzilmalarida o'xshashlik bo'lsa, gibridlanish mumkin.
Rasm - Turli DNK molekulalari orasidagi gibridlanish
DNK molekulalari orasidagi o'xshashlik qanchalik yuqori bo'lsa, gibridlanish darajasi shunchalik yuqori bo'ladi. Turli xil turdagi tirik organizmlarning DNKlari o'rtasidagi duragaylash natijalariga asoslanib, ularning munosabatlarini baholash mumkin. Duragaylanish darajasi qanchalik yuqori bo'lsa, tahlil qilinadigan turlar o'rtasidagi munosabatlar shunchalik yaqin bo'ladi.
Gibridlanish DNK va RNK molekulalari o'rtasida ham mumkin, agar homolog nukleotidlar ketma-ketligi mavjud bo'lsa.
Rasm - DNK va RNK o'rtasidagi gibridlanish
4. Nuklein kislotalar ultrabinafsha nurlarini kuchli yutadi va bu xususiyat ularning konsentratsiyasini aniqlash uchun asosdir. Ultrabinafsha nurlarning mutagen ta'siri ham shu xususiyat bilan bog'liq.
Eukaryotik DNKning tashkil etilishi
Eukaryotik DNK molekulasining uzunligi hujayra hajmidan ko'p marta katta. Turli xil biologik jarayonlarning borishini ta'minlash uchun uni to'g'ri qadoqlash kerak. Uning siqilishining bir necha darajalari mavjud.
1. Yalang'och DNK - qo'sh spiral bo'lib, diametri 1,8 nm˸
Bunday DNK DNazalarga - fosfodiester bog'larini gidrolizlovchi fermentlarga o'ta sezgir.
DNKning fizik-kimyoviy xossalari - tushunchasi va turlari. "DNKning fizik-kimyoviy xossalari" toifasining tasnifi va xususiyatlari 2015, 2017-2018 yillar.

DNKning erishi - chiziqli DNK molekulasining muntazam qo'sh spiralining o'ralgan holatga o'tish jarayoni. Spiral-spiral o'tish turli omillar tufayli yuzaga kelishi mumkin, ammo, qoida tariqasida, harorat o'zgarishi tekshiriladi. O'tishni kuzatish turli usullar bilan amalga oshirilishi mumkin, chunki u DNKning ko'plab jismoniy xususiyatlarining o'zgarishi bilan birga keladi (Kantor C. va Shimmel P., 1984), ko'pincha o'tish darajasini miqdoriy o'lchash uchun, a l = 250 270 nm to'lqin uzunligi oralig'ida DNK eritmasi tomonidan yorug'likning yutilishining o'zgarishi. DNKning spiral holatdan spiralsimon holatga o'tishida bu to'lqin uzunligi hududida A eritmasining yutilishi 30-40% ga oshadi va o'tishning o'rtacha darajasini aniqlash uchun q, ya'ni. o'ralgan holatdagi havolalar nisbati uchun siz nisbatdan foydalanishingiz mumkin:

q, = (A - A cn) / (A cl - A cn) (1),
Bu erda A cn va A cl mos ravishda DNKning to'liq spiral va to'liq o'ralgan holatda qabul qilinishini bildiradi. Bu usul 0,1% dan yuqori aniqlik bilan q ni ro'yxatdan o'tkazish imkonini beradi. Yuqori molekulyar og'irlikdagi DNKning erishi molekula bo'ylab AT va GC juftlarining tarqalishiga qarab 3 dan 20 darajagacha bo'lgan harorat oralig'ini oladi. Bunday DNK erishining eng oddiy xarakteristikasi sifatida odatda erish harorati T m ishlatiladi, bu molekula birliklarining yarmi o'ralgan holatda bo'lgan harorat sifatida aniqlanadi. Berilgan erituvchi tarkibi uchun erish harorati chiziqli ravishda DNKdagi GC juftlarining ulushiga bog'liq, x GC (Kantor C. va Shimmel P., 1984):
T m = T AT + (T GC - T AT) * x GC (2),
bu yerda T AT va T GC mos ravishda faqat AT va faqat GC juftlaridan tashkil topgan DNK molekulalarining erish temperaturalarini bildiradi.
70-yillarning o'rtalarida DNKning erish egri chizig'i, ya'ni. q ning T ga bog'liqligi, agar DNK uzunligi bir necha o'n minglab asos juftlaridan oshmasa, nozik tuzilishga ega (Dikerson R.E., 1983). Bu nozik struktura, ayniqsa, differensial erish egri chizig'ida yaqqol namoyon bo'ladi, ya'ni dq / dT ning T ga bog'liqligi. Bunday differensial erish egri chizig'iga misol fd fagining DNK qismi uchun ko'rsatilgan. Bunday egri chiziqlar aks ettiradigan o'ziga xos erish profili tekshirilayotgan DNKdagi asosiy ketma-ketlik bilan belgilanadi. Differensial erish egri chizig'idagi bu cho'qqilar bir necha yuz tayanch juftligining xarakterli o'lchamiga ega bo'lgan molekulaning alohida hududlari darajasining bir necha o'ndan bir qismi oralig'ida erishi bilan bog'liq.
DNKda spiral-spiral o'tishning yaxshi rivojlangan statistik-mexanik tavsifi mavjud. Erish egri chizig'ining nozik tuzilishini kashf qilish va uzun DNK ketma-ketliklarini dekodlash spiral-spiral o'tishini nazariy tavsiflash imkoniyatlarini juda muhim sinovdan o'tkazish imkonini berdi. Uzunligi bir necha ming tayanch juftgacha bo'lgan DNK erishining nazariy va eksperimental profillarini to'g'ridan-to'g'ri taqqoslash shuni ko'rsatdiki, o'tishning statistik-mexanik modeli haqiqiy DNK erishini yaxshi tasvirlaydi. Bunday taqqoslashning juda tipik misoli rasmda ko'rsatilgan. Differensial erish egri chiziqlari.
Salbiy o'ta o'ralgan DNKning erishi mos keladigan chiziqli molekulalarning erishiga qaraganda ancha past haroratlarda boshlanadi va ancha yuqori haroratlarda tugaydi. Ko'rinib turibdiki, o'ta burilish kuchlanishining belgisi qo'sh spiralning ochilishiga yordam berguncha, ya'ni. denaturatsiya darajasi q s qiymatidan kam bo'lsa, bu kuchlanish denatürasyona yordam berishi kerak. Agar q s dan katta yoki unga teng bo'lsa, eritilgan hududlar qoldiq burilish hosil qila boshlaydi, chunki spiral mintaqalardagi burilish molekulada zanjir bog'lash tartibini amalga oshirish uchun endi etarli emas va shuning uchun topologik cheklovlar DNKning keyingi erishiga to'sqinlik qiladi. . Aylana yopiq DNKning erish xarakterini aniqlovchi AT va GC asos juftlarining zanjir bo‘ylab taqsimlanishi va ularning nisbiy barqarorligi emas, balki topologik cheklovlardir. Bu (Gagua A.V. ea, 1981) ishda ishonchli tarzda ko'rsatildi, bu erda tetrametilammoniy tuzlarida DNKning aylana yopiq shakli erishi o'rganildi, uning ma'lum bir konsentratsiyasida AT va GC juftlarining erish haroratlari mos keladi. Bunday sharoitda chiziqli DNKning erish diapazoni bir necha o'ndan bir darajagacha torayadi (Melchior W.B. va von Hippel P.H., 1973 va Voskoboinik A.D. va boshqalar, 1975). Biroq, CG shaklining erishi tabiati amalda o'zgarmaydi va o'tish juda keng bo'lib qoladi, 55 ° C dan boshlab va 110 ° C da tugaydi.
DNK gibridizatsiyasi