Rasm Turli dnk molekulalari orasidagi gibridlanish

DNK gibridizatsiyasi, nuklein kislotalarning gibridlanishi- ulanish in vitro Bir molekulada bir-birini to'ldiruvchi bir zanjirli nuklein kislotalar. To'liq to'ldiruvchilik holatida birlashish oson va tez sodir bo'ladi, qisman qo'shimcha bo'lmagan taqdirda esa, zanjirlarning birlashishi sekinlashadi, bu esa to'ldiruvchilik darajasini baholashga imkon beradi. DNK-DNK va DNK-RNKning gibridlanishi mumkin.
Tajriba jurnali

1. 
   Ikki zanjirli DNK tegishli buferda isitiladi. Tashqi sharoitlarning o'zgarishi tufayli komplementar azotli asoslar orasidagi vodorod bog'lari termodinamik jihatdan noqulay bo'lib, zanjirlar ajralib chiqadi.
   
2. 
   Denatüratsiyalangan DNK preparati boshqa denaturatsiyalangan DNK bilan aralashtiriladi.
   
3. 
   Preparatlar asta-sekin sovutiladi, bir zanjirli DNK esa bir-biriga tavlanadi (komplementar asoslar o'rtasida vodorod bog'lari hosil bo'ladi), shu bilan "gibrid" DNK molekulasini hosil qiladi.
   

Bir zanjirli DNKning tavlanish tezligini tahlil qilish bir turdagi turlar yoki individlar o'rtasidagi DNK ketma-ketligidagi o'xshashlik va farqlarni baholashga imkon beradi.
DNKning erish nuqtasini hisoblash
DNKning ikkilamchi tuzilishi biologiya, genetik diagnostika va molekulyar biologiya va nanotexnologiyaning boshqa usullarida muhim rol o'ynaydi. Shuning uchun DNK yoki RNK molekulalarining erish nuqtasini aniq aniqlash barcha molekulyar biologik usullarda, masalan, mikroarraylar uchun namunalar yoki oligonükleotidlarni tanlash yoki PCR primerlarini tanlash uchun eng muhim rol o'ynaydi. Qisqa oligonukleotidlar uchun erish nuqtasini hisoblash uchun bir nechta oddiy formulalar mavjud. Qisqa oligonukleotidning erish nuqtasini (T m) qo'pol hisoblash (<20 нуклеотидов) проводят по прямому подсчету количества нуклеотидов (G+C - сумма всех гуанинов и цитозинов , L - длина олигонуклеотида):
K + va DMSO ionlarining kontsentratsiyasini hisobga olgan holda qisqa oligonukleotid (va uzoq DNK bo'laklari uchun) uchun T m ni hisoblashning o'rtacha formulasi:
Biroq, bu tenglamalar oliginukleotidning gibridlanishi paytida bog'lanishning boshlanishini hisobga olmaydi, ketma-ketlikning o'ziga xos xususiyatlarini va oligonukleotid duplekslariga xos bo'lgan yakuniy effektni hisobga olmaydi. Shuning uchun, bu formula ko'proq mos keladi, bu erda DNK ketma-ketligi o'rtacha hisoblanadi va duplekslarning uzunligi 40 dan ortiq nukleotidlardir.
DNK termodinamiği
Ikki zanjirli yoki bir zanjirli DNKning erish nuqtasini hisoblash uchun bugungi kunda eng keng tarqalgan usul ikki bosqichli termodinamik modelga asoslangan. Ikkita to'ldiruvchi DNK molekulalari A va B, bir-biri bilan bog'langan yoki eritmada erkin ("tasodifiy sariq holati"). Odatda A va B molekulalari bir-birini to‘liq to‘ldiruvchi deb hisoblanadi, shuning uchun ularning gibridlanishi aniq va dupleksda bir yoki bir nechta komplementarlik xatolariga yo‘l qo‘yiladi, shu jumladan qo‘shimcha bo‘lmagan G-G, G-T va G-A juftliklari (chayqalish juftlari). Faqat bitta molekula bo'lsa, u halqa tuzilishiga o'ralgan deb taxmin qilinadi. Dupleks gibridlanish jarayoni quyidagi formula bilan tavsiflanadi:
bu erda A va B eritmadagi turli davrlar ("tasodifiy lasan holati"), AB esa hosil bo'lgan dupleksdir. Bu reaktsiya teskari. Muvozanat konstantasi k, bu reaksiya uchun quyidagicha aniqlanadi:.
Muvozanat konstantasi zanjirlar konsentratsiyasiga, haroratga, tuz konsentratsiyasiga, pH va reaksiyadagi boshqa komponentlarga (masalan, glitserin yoki DMSO) bog'liq. Doimiy K bir yoki ikkala zanjirning (va / yoki) konsentratsiyasining o'zgarishiga javoban o'zgaradi, keyin butun tizim o'zgarishlarga javob beradi va keyin individual konsentratsiyalar [A], [B] ham o'zgaradi. Misol uchun, agar tizimda A zanjiri ko'proq bo'lsa, u holda konsentratsiya ortadi. Faraz qilaylik, muvozanat konstantasi 1,81x10 6 va zanjirlar konsentratsiyasi = = 10 -5 M:
k ni hisoblash uchun formulalardagi komponentlarni almashtiramiz:
Qayta tartibga solishdan keyin biz quyidagilarni olamiz:
Misol uchun, bu formulada almashtiring = 7,91x10 -6 M keyin zanjirlar konsentratsiyasi [A] = [B] = 2,09x10 -6 M bo'ladi. Ya'ni, zanjirlarning faqat 79% duplekslanadi.
Harorat o'zgarganda muvozanat konstantalarini aniqlash mumkinmi? Bu bizga erkin energiya (dG), entalpiya (dH) va entropiya (dS) kabi muhim termodinamik parametrlarni tushunishga olib keladi. Erkin energiya, entalpiya va entropiyaning o'zgarishi "harorat T gibridlanishi" dan tartibsiz, tasodifiy holatga o'tish jarayonida sodir bo'ladi. Bu nisbatlar dG = dH - TdS formulasi bilan aniqlanadi (zanjirlar konsentratsiyasi [A] = [B] = = 1M uchun), keyin Gibbsning erkin energiyasini hisoblash uchun ideal formula:
bu erda T - kelvindagi harorat, dH ° (kal / mol) va dS ° (kal / mol K).
Kimyoviy reaksiya davomida Gibbsning erkin energiyasining oʻzgarishini uning muvozanat konstantasi bilan bogʻlovchi foydali bogʻliqlik mavjud:
bu erda R universal gaz doimiysi (1,987kal / mol K).
Ikkala formulani birlashtirib, biz quyidagilarni olamiz:
Erish nuqtasi (T m) muvozanat holatida, zanjirlarning yarmi bir-biriga bog'langan va ikkinchi yarmi erkin holatda bo'lganda aniqlanadi, ya'ni k = 1:
Oddiy halqa uchun erish nuqtasi quyidagicha hisoblanadi. DNK dupleksi uchun har bir ipning kontsentratsiyasini hisobga olish kerak (molda, M). Shunday qilib, agar [A] va [B] A va B molekulalarining konsentratsiyasi bo'lsa, unda zanjirlarning umumiy konsentratsiyasi, C ularning yig'indisiga teng, [A] + [B].
Ikkala zanjirning konsentratsiyasi bir xil [A] = [B] = C / 2 deb taxmin qilinadi. Unday bo `lsa,
Bu erda f = 4. O'z-o'zini to'ldiruvchi oligonukleotid uchun = C va keyin f = 1. Bu erish nuqtasi faqat molekulalarning yarmi bir-biriga bog'langan holatda aniqlanadi.
O'z-o'zini to'ldiruvchi oligonukleotid uchun k = 1 / shuning uchun:
Qo'shimcha bo'lmagan dupleks uchun, ≥, k = 1 / (- / 2) bo'lganda, Tm quyidagicha hisoblanadi:
bu erda ustun bo'lgan ipning molyar konsentratsiyasi (odatda PCR primeri) va [Bt] - past konsentratsiyali zanjirning molyar konsentratsiyasi (genomik DNK).
Erish nuqtasini hisoblash
Termodinamik parametrlar dG, dH va dS eng yaqin qo'shni modelidan hisoblanadi. Dinamik dasturlash algoritmlari yordamida duragaylash jarayonida DNKning ikkilamchi tuzilishini aniq bashorat qilish uchun har bir qo‘shimcha asos juftligi uchun barcha mumkin bo‘lgan termodinamik parametrlar, shuningdek nukleotidlari mos kelmaydigan barcha variantlar, bo‘sh uchlari, soch iplari va halqalar uchun ma’lumotlar bazasi talab qilinadi. Qisqa oligonukleotidni hisoblash uchun termodinamik formula to'rt nukleotid birikmalarining 10 ta variantining har biri uchun termodinamik parametrlarga - entropiya dS va entalpiya dH ga asoslanadi (1-jadval). 1-jadvalda 1M NaCl kontsentratsiyasida asosiy juftliklar uchun eng yaqin qo'shnilar (NN) uchun termodinamik parametrlar keltirilgan.
Tm (° S) ni hisoblash uchun Gibbsning erkin energiyasining barcha qiymatlari bir nukleotid qadami bo'lgan har bir juftlik uchun yig'iladi:
dG umumiy = dG boshlang'ich + dG simmetriya + ∑dG + dG AT oxiri
dG nazariy = 1,96 + 0 - 2,17 - 1,44 - 1,44 - 1,00 - 1,45 - 1,30 +0,05
dG nazariy = -5,35 kkal / mol
Entropiya (dH = -43,5 kkal / mol) va entalpiya (dS = -122,5) qiymatlari shunga o'xshash tarzda hisoblanadi:
Ko'pgina DNK duplekslarida raqobatlashuvchi bir zanjirli tuzilmalar mavjud va bu tizimning muvozanatini o'zgartiradi va natijada T m qiymatini formula bo'yicha taxmin qilingan qiymatdan kamaytiradi.
Eritmadagi tuz uchun tuzatilgan T m ni hisoblashning umumiy formulasi:
Bu erda L - oligonukleotidning uzunligi, R - gaz konstantasi (1,987kal / K mol), c - oligonukleotidning kontsentratsiyasi (odatda 2x10 -7 M), mollardagi kaliy ionlarining konsentratsiyasi (odatda 5x10 -). 2 M).
Jadval 1. 1M NaCl konsentratsiyasida nukleotid juftlari uchun eng yaqin qo'shnilar (NN) uchun termodinamik parametrlar,

Juftlar ketma-ketligi (5"-3"/3"-5")	° kkal / mol	° kal / (mol K)	° 37 kkal / mol
AA / TT	-7.6	-21.3	-1.00
AT / TA	-7.2	-20.4	-0.88
TA / AT	-7.2	-20.3	-0.58
CA / GT	-8.5	-22.7	-1.45
GT / CA	-8.4	-22.4	-1.44
CT / GA	-7.8	-21.0	-1.28
GA / CT	-8.2	-22.2	-1.30
CG / GC	-10.6	-27.2	-2.17
GC / CG	-9.8	-24.4	-2.24
GG / CC	-8.0	-19.9	-1.84
boshlash	+0.2	-5.7	+1.96
end A-T juftligi	+2.2	+6.9	+0.05
simmetriyani tuzatish	0.0	-1.4	+0.43

Dupleks ichida bitta xato
Qo'shimcha nukleotid juftlari uchun eng yaqin qo'shni model qo'shimcha bo'lmagan nukleotidlarni o'z ichiga olishi uchun juftlikka kengaytirilishi mumkin. To'ldiruvchi bo'lmagan bazaviy juftliklar barqarorligining pasayish tendentsiyasi mavjudligi ko'rsatilgan: