Proteinopatiyalar

PROTEINOPATIYALAR.

Yilda Dori, proteopatiya (/proʊtiːˈɒpəθiː/; proteo- dan [pref. oqsil]; -patiya [suff. kasallik]; proteopatiyalar pl.; proteopatik adj) sinfiga ishora qiladi kasalliklar unda aniq oqsillar tizimli ravishda g'ayritabiiy holga keladi va shu bilan funktsiyasini buzadi hujayralar, to'qimalar va organlar tananing.^[1][2] Ko'pincha oqsillar muvaffaqiyatsizlikka uchraydi ularning normal konfiguratsiyasiga o'ting; bu noto'g'ri shaklda, oqsillar biron bir tarzda toksikka aylanishi mumkin (toksik) funktsiyani oshirish) yoki ular odatdagi funktsiyalarini yo'qotishi mumkin.^[3] Proteopatiyalar (shuningdek, tanilgan proteinopatiyalar, oqsil konformatsion kasalliklari, yoki oqsilni noto'g'ri tarqatadigan kasalliklarkabi kasalliklarni o'z ichiga oladi Kreuzfeldt-Yakob kasalligi va boshqalar prion kasalliklari, Altsgeymer kasalligi, Parkinson kasalligi, amiloidoz, bir nechta tizim atrofiyasiva boshqa turli xil kasalliklarning keng doirasi.^{[2][4][5][6][7][8]} Atama proteopatiya birinchi marta 2000 yilda taklif qilingan Leri Uoker va Garri Levin.^[1]

Proteopatiya tushunchasi uning kelib chiqishini XIX asrning o'rtalaridan boshlab, 1854 yilda, Rudolf Virchov atamani o'ylab topdi amiloid ("kraxmalga o'xshash") miyadagi moddalarni tavsiflash uchun korpus amilatseya ga o'xshash kimyoviy reaktsiyani namoyish etdi tsellyuloza. 1859 yilda, Fridrix va Kekule "amiloid" tsellyulozadan iborat emas, balki aslida oqsilga boy ekanligini namoyish etdi.^[9] Keyingi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, ko'plab turli xil oqsillar amiloid hosil qilishi mumkin va barcha amiloidlar namoyon bo'ladi ikki tomonlama buzilish xochdaqutblangan nur bo'yoq bilan bo'yalganidan keyin Kongo qizil, shuningdek fibrillyar ultrastruktura bilan ko'rib chiqilganda elektron mikroskop.^[9] Shu bilan birga, ba'zi oqsilli lezyonlar bir tekis sinish qobiliyatiga ega emas va klassik amiloid fibrillalarni kam yoki umuman o'z ichiga olmaydi, masalan Altsgeymer bilan kasallangan odamlarning miyasida amiloid beta (Aβ) oqsilining diffuz konlari.^[10] Bundan tashqari, kichik, fibrillar bo'lmagan oqsil agregatlari deb nomlanuvchi dalillar paydo bo'ldi oligomerlar ta'sirlangan organ hujayralari uchun toksik bo'lib, ularning fibrillyar shaklida amiloidogen oqsillar nisbatan benign bo'lishi mumkin

Ko'pgina hollarda, agar hamma proteopatiyalar bo'lmasa ham, 3 o'lchovli katlamaning o'zgarishi (konformatsiya) ma'lum bir oqsilning o'ziga bog'lanish tendentsiyasini oshiradi.^[5] Ushbu birlashtirilgan shaklda oqsil klirensga chidamli va ta'sirlangan organlarning normal imkoniyatlariga xalaqit berishi mumkin. Ba'zi hollarda, oqsilning noto'g'ri birikishi odatdagi funktsiyani yo'qotishiga olib keladi. Masalan, kistik fibroz nuqson tufayli kelib chiqadi kistik fibroz transmembran o'tkazuvchanlik regulyatori (CFTR) oqsil,^[3] va amyotrofik lateral skleroz / frontotemporal lobar degeneratsiyasi (FTLD) da ba'zi genlarni tartibga soluvchi oqsillar sitoplazmada noo'rin birikadi va shu bilan yadro ichidagi normal vazifalarini bajara olmaydi.^[13][14] Chunki oqsillar umumiy tuzilish xususiyatiga ega polipeptid umurtqa pog'onasi, barcha oqsillar ba'zi holatlarda noto'g'ri ochilish qobiliyatiga ega.^[15] Shu bilan birga, faqat nisbatan oz miqdordagi oqsillar proteopatik kasalliklar bilan bog'liq bo'lib, ehtimol bu zaif oqsillarning strukturaviy o'ziga xos xususiyatlariga bog'liq. Masalan, odatda ochilgan yoki nisbatan beqaror bo'lgan oqsillar monomerlar (ya'ni bitta, bog'lanmagan oqsil molekulalari kabi) g'ayritabiiy konformatsiyaga aylanib ketishi ehtimoli katta.^[5][15][16] Deyarli barcha holatlarda kasallikka olib keladigan molekulyar konfiguratsiya o'sishni o'z ichiga oladi beta-varaq oqsilning ikkilamchi tuzilishi.^{[5][15][17][18]} Ba'zi proteopatiyalardagi g'ayritabiiy oqsillar bir nechta 3 o'lchovli shakllarga o'ralganligi isbotlangan; bu variantli, oqsilli tuzilmalar turli patogen, biokimyoviy va konformatsion xususiyatlari bilan belgilanadi.^[19] Ular bu borada to'liq o'rganilgan prion kasalligi, va oqsil deb nomlanadi shtammlar. Proteopatiyaning rivojlanish ehtimoli aniq oshadi xavf omillari oqsilning o'zini o'zi yig'ishiga yordam beradi. Bularga boshlang'ichdagi beqarorlashtiruvchi o'zgarishlar kiradi aminokislota oqsilning ketma-ketligi, tarjimadan keyingi modifikatsiyalar (kabi giperfosforillanish), haroratning o'zgarishi yoki pH, oqsil ishlab chiqarishning ko'payishi yoki uning klirensining pasayishi.^[1][5][15] Qarish yoshi kuchli xavf omilidir,^[1] travmatik miya shikastlanishi kabi.^[22][23] Qarigan miyada ko'plab proteopatiyalar bir-biri bilan qoplanishi mumkin.^[24] Masalan, qo'shimcha ravishda taopatiya va A-amiloidoz (Altsgeymer kasalligining asosiy patologik xususiyatlari sifatida mavjud), ko'plab Altsgeymer bemorlarida sinukleinopatiya kuzatiladi (Lewy organlari) miyada.^[25]

Bu taxmin qilingan chaperones va she-chaperonlar (yordam beradigan oqsillar) oqsilni katlama) qarish paytida va oqsilning ko'payishi kasalliklarida proteotoksikani antagonize qilishi mumkin proteostaz

Ba'zi oqsillar kasallik keltirib chiqaradigan konformatsiyaga o'ralgan bir xil (yoki shunga o'xshash) oqsil ta'sirida g'ayritabiiy birikmalar hosil bo'lishiga olib kelishi mumkin, bu jarayon "urug '" yoki "ruxsat beruvchi templat" deb nomlanadi.^[29][30] Shunday qilib, kasallik holatini sezgir holatga keltirish mumkin mezbon zararlangan donordan kasallangan to'qimalar ekstraktini kiritish orqali. Bunday indüklenebilir proteopatiyaning eng yaxshi ma'lum bo'lgan shakli prion kasalligi,^[31] xasta organizmni kasallik keltirib chiqaradigan konformatsiyada tozalangan prion oqsili ta'sirida yuqishi mumkin.^[32][33] Hozir boshqa proteopatiyalarni shu kabi mexanizm bilan qo'zg'atishi mumkinligi haqida dalillar mavjud, shu jumladan Aβ amiloidoz, amiloid A (AA) amiloidoz va apolipoprotein AII amiloidoz,^[30][34] taopatiya,^[35] sinukleinopatiya,^{[36][37][38][39]} va ning yig'ilishi superoksid dismutaz-1 (SOD1),^[40][41] poliglutamin,^[42][43] va TAR DNK bilan bog'laydigan oqsil-43 (TDP-43). Ushbu holatlarning barchasida oqsilning aberrant shakli patogen agent bo'lib ko'rinadi. Ba'zi hollarda oqsillarning bir turini cho'ktirishni, ehtimol, oqsil molekulalarining strukturaviy komplementarligi tufayli, b-varaq tarkibiga boy bo'lgan boshqa oqsillarning yig'ilgan yig'indilari tomonidan induksiya qilish mumkin. Masalan, sichqonlarda AA amiloidozini bunday xilma-xilligi bilan rag'batlantirish mumkin makromolekulalar ipak kabi xamirturush amiloid Sup35 va jingalak fibrillalar bakteriyadan Escherichia coli.^[45] Bundan tashqari, apolipoprotein AII amiloid sichqonlarga turli xil b-varaqqa boy amiloid fibrillalari tomonidan kiritilishi mumkin,^[46] va miya tauopatiyasini umumiy Aβ ga boy bo'lgan miya ekstraktlari keltirib chiqarishi mumkin.^[47] Prion oqsili va Aβ o'rtasida o'zaro urug 'ekish bo'yicha eksperimental dalillar mavjud.^[48] Umuman olganda, bunday heterologik urug'lik bir xil oqsilning buzilgan shakli bilan ekishdan ko'ra samarasiz. Ko'pgina proteopatiyalar uchun samarali davolash usullarini ishlab chiqish juda qiyin bo'lgan.^[73][74] Proteopatiyalar ko'pincha turli xil manbalardan kelib chiqadigan turli xil oqsillarni o'z ichiga olganligi sababli, davolanish strategiyalari har bir kasallikka moslashtirilishi kerak; ammo, umumiy terapevtik yondashuvlarga ta'sirlangan organlarning funktsiyasini saqlab qolish, kasallik keltirib chiqaruvchi oqsillarning shakllanishini kamaytirish, oqsillarning noto'g'riligini va / yoki birikishini oldini olish yoki ularni yo'q qilinishini targ'ib qilish kiradi.^[75][73][76] Masalan, Altsgeymer kasalligida tadqiqotchilar, kasallik bilan bog'liq bo'lgan Aβ proteinini ishlab chiqarishni inhibe qilish orqali kamaytirish yo'llarini qidirmoqdalar. fermentlar uni ota-ona oqsilidan ozod qiladi.^[74] Boshqa strategiya - foydalanish antikorlar faol yoki passiv ravishda o'ziga xos oqsillarni zararsizlantirish immunizatsiya.^[77] Ba'zi proteopatiyalarda oqsil oligomerlarining toksik ta'sirini inhibe qilish foydali bo'lishi mumkin.^[78] Amiloid A (AA) amiloidozini davolash orqali kamaytirish mumkin yallig'lanish qondagi oqsil miqdorini ko'paytiradigan holat (deyiladi sarum amiloid A yoki SAA).^[73] Yilda immunoglobulin yorug'lik zanjiri amiloidoz (AL amiloidoz), kimyoviy terapiya turli xil tana a'zolarida amiloid hosil qiladigan engil zanjirli oqsilni hosil qiladigan qon hujayralari sonini kamaytirish uchun ishlatilishi mumkin.^[79] Transtiretin (TTR) amiloidoz (ATTR) noto'g'ri katlanmış TTRni bir nechta organlarga yotqizishidan kelib chiqadi.^[80] TTR asosan ishlab chiqarilganligi sababli jigar, TTR amiloidozi ba'zilarida sekinlashishi mumkin irsiy jigar tomonidan holatlar transplantatsiya.^[81] TTR amiloidozini oqsilning normal birikmalarini barqarorlashtirish orqali ham davolash mumkin (deyiladi tetramerlar chunki ular to'rtta TTRdan iborat molekulalar bir-biriga bog'langan). Stabilizatsiya individual TTR molekulalarining qochib ketishidan, noto'g'ri birikishidan va amiloidga birikishidan saqlaydi. Oqsillarning birlamchi tuzilishi bu polipeptid zanjiridagi aminokislota qoldiqlari ketma-ketligidir. Oqsil tarkibidagi aminokislotalarning tartibi genetik jihatdan DNKdagi nukleotidlar ketma-ketligi bilan belgilanadi. Polipeptid bitta aminokislotaning karboksil guruhi bilan boshqa aminokislotaning aminoguruhi - peptid bog'lanishining o'zaro ta'siri natijasida hosil bo'ladi.

Bir aminokislotaning boshi (NH2-) boshqa aminokislotaning dumiga (-COOH) biriktirilgan. Oqsilning birlamchi tuzilishidagi yagona bog'lanish turi bo'lgan aminokislotalar orasida peptidli bog'lanish (-CO-NH-) yopiladi. Yuqoridagi sxemadan ko'rinib turibdiki, peptid bog'lanishini hosil qilish paytida suv ajralib chiqadi. Gidroliz paytida peptid bog'lanishining bo'linishi ajraladigan bog'lanish joyida suv qo'shilishi bilan birga keladi. Oqsil va polipeptid gidrolizining yakuniy mahsuloti erkin aminokislotalardir.

Peptid aloqasi uglerod va azot o'rtasidagi yagona bog'lanishlarga qaraganda kuchliroqdir, chunki tautomerizm natijasida u 40% ga ikki baravar ko'payadi. Xuddi shu sababga ko'ra, polipeptid zanjirida faqat radikal bilan bog'langan uglerod atomlari atrofida aylanish mumkin

Skeletlari barcha polipeptidlar uchun bir xildir. Polipeptid zanjirlari radikallarning tabiati va ketma-ketligi bilan farq qiladi. Polipeptid uni tashkil etuvchi aminokislota qoldiqlari soniga qarab nomlanadi: dipeptid, tripeptid va boshqalar.

Proteinlar 50 dan ortiq aminokislota qoldiqlarini o'z ichiga olgan polipeptidlardir. Eng oddiy protein insulin. Uning tarkibida atigi 51 ta aminokislota qoldig'i mavjud. Ribonukleaz tarkibida 124 qoldiq, 574 gemoglobin mavjud.

Oqsillarda aminokislotalarning ketma-ketligi, ya'ni birlamchi tuzilishi qat'iy belgilangan. Bir aminokislotaning qoldig'ini boshqasiga almashtirish yangi oqsil beradi. Shunday qilib, qoramol insulinida to'qqizinchi o'rinda serin qoldig'i, qo'chqor insulinda esa glitsin bo'ladi. Odam va ot insulinida farqlar uchta aminokislota qoldig'i bilan bog'liq - sakkizinchi, to'qqizinchi va o'ninchi. Ushbu insulinlarning barchasi boshqacha tuzilishga ega. Bir xil funktsiyaga ega turli xil organizmlarning oqsillari gomologik deb nomlanadi.

Oqsillarning ikkilamchi tuzilishi

Oqsillarning ikkilamchi tuzilishining ikkita asosiy turi mavjud: spiral va katlamali qatlam.

Spirallar ... Polipeptid zanjiridagi a-uglerod atomi atrofida bog'lanishlarning erkin aylanishi tufayli polipeptid zanjirining chiziqliligi buziladi. Bu spirallarning shakllanishiga olib keladi. Spirallarning 3 turi mavjud.

1. Keratin xarakterlanadi a-c piral... Keratinning polipeptid zanjiri xayoliy silindr atrofida o'ralgan. Bir-biriga yaqin bobinlar vodorod aloqalari bir peptid bog'lanishining kislorodi bilan boshqa peptid bog'lanishining vodorodi o'rtasida. Vodorod aloqalari kislorod va vodorod o'rtasidagi kovalent bog'lanishlarga qaraganda 20 marta kuchsizroq, ammo ularning ko'pligi tufayli ular ancha kuchli va spiralni ushlab turadi.

2. β -spiral bakteriyalar oqsilida uchraydi. P-spiralning bir burilishi 22 ta aminokislota qoldig'idan iborat, b-spirali ichi bo'sh naycha, a-spirali to'ldirilgan silindr.

3. Buzilgan spiral kollagen uchun xosdir. Ushbu turdagi spiral spiralning "to'g'riligini" buzadigan kollagen - aminokislotalar tarkibidagi glitsin va prolin tarkibidagi gidroksiprolin bilan yuqori darajada bo'lishining natijasidir.

Dan devor qatlami ipak oqsiliga xos - fibroin. Katlanmış qatlamdagi qo'shni zanjirlarning yo'nalishi bir-biriga qarama-qarshi (antiparallel) zanjirlardir vodorod aloqalari

Fibrillar oqsillaridagi spirallar va katlamli qatlamlar ko'pincha o'ta ikkilamchi tuzilmalarni yoki supero'tkazilishlarni keltirib chiqaradi. Shunday qilib, 7 a-spiral keratin superko'pni beradi. O'z navbatida, 11 keratinli supero'tkazgichlar soch mikrofibrilasini hosil qiladi.

Sharsimon oqsillarning ikkilamchi tuzilishi fibrillyar oqsillar singari bir xil emas. Shunday qilib, miyoglobin molekulasida polipeptid zanjirining 77% spirallanadi va 23% spiralizatsiya qilinmaydi. Insulin spiralizatsiyasi darajasi 60%, tuxum albumini - 40%, pepsin - 28%. Kimotripsinning polipeptid zanjiri deyarli spirallangan hududlarni o'z ichiga olmaydi, ammo bu erda buklangan, qatlamlar, ilmoqlar, burmalar va boshqalar mavjud.

Molekulyar og'irligi 20 ming Da dan yuqori bo'lgan globusli oqsillarning tarkibida bu tushuncha ajralib turadi domen - xarakterli tuzilishga ega bo'lgan 100-150 aminokislota qoldiqlaridan iborat kichik joylar. Ular strukturaviy domenlar deb ataladi.

Domenlar va domen ichidagi alohida tuzilmaviy elementlar o'rtasida shunday atalmish mavjud menteşe bo'limlari ... Xuddi shu turdagi bir nechta o'xshash domenlar ko'pincha bitta oqsilda uchraydi.

Bundan tashqari, kontseptsiya mavjud funktsional domen ... Ikkinchi holda, bir yoki bir nechta strukturaviy domenlar birgalikda oqsil molekulasida funktsional ravishda alohida mintaqani hosil qiladi: substrat maydoni, ferment yoki inhibitorning faol markazi uchun muhit, membranadagi ion kanali va boshqalar.

Uchinchi darajali tuzilish - uch o'lchovli bo'shliqda polipeptid zanjirining joylashishi (o'ralgan, past o'ralgan yoki o'ralmagan).

Sharsimon spiralning ko'rinadigan buzilishiga qaramay, uning tuzilishi qat'iy belgilangan va ba'zi qonuniyatlarga ega.

1. Globulyadagi polipeptid zanjirlari juda zich joylashgan.

2. Odatda, oqsilning qutbli guruhlari globulaning yuzasida, hidrofobik radikallar esa uning ichida yashiringan.

Aseton "href \u003d" / text / category / atceton / "rel \u003d" bookmark "\u003e aseton oqsillari cho'kadi. Bunday yog'ingarchilik deyiladi tuzlash... Tuzlanish mexanizmi shundan iboratki, alkogol va asetonning tuzlari va molekulalarining ionlari, o'zlarining kuchli hidratsiya qobig'iga ega bo'lib, suvni oqsil molekulasidan tortib olishadi. Turli xil protein konsentratsiyasida tuzlanadi. Globulinlar ammoniy sulfatning yarim to'yingan eritmasida, albumin esa faqat shu tuzning to'yingan eritmasida tuzlanadi. Fraksiyonel tuzlash oqsillarni ajratish va tozalash uchun ishlatiladi.

Ba'zi oqsillar mos keladigan pH qiymatida cho'kadi izoelektrik nuqta... Shunday qilib, kazein pH 4.7 da cho'kadi, chunki bu pH qiymatida molekulalar zaryadga ega emas va tezda eritmada beqaror bo'lgan katta zarrachalarga birlashadi. Boshqa oqsillar barqarorroq bo'lib, ularning cho'kishi oqsillarga qarshilik ko'rsatishning ikkala omiliga ta'sir ko'rsatishni talab qiladi.

Proteinli dializ

Katta o'lchamlari tufayli oqsil molekulalari ba'zi plyonkalar orqali o'tmaydi; selofan, baliq pufagi va boshqalar. Bu xususiyat oqsillarni past molekulyar og'irlikdagi aralashmalardan tozalash uchun, ya'ni dializ uchun ishlatiladi.

Ion almashinadigan xromatografiya ham aralashmadagi ajratilgan moddalarning zaryadi farqiga asoslangan.

Oqsillarni denaturatsiyasi

Denaturatsiya - bu oqsillarning tuzilishidagi har qanday gidrolitik bo'lmagan o'zgarish, ularning biologik faolligi va funktsiyalari o'zgarishi bilan birga keladi. Denaturatsiyaga ko'plab omillar sabab bo'lishi mumkin: qaynash, yuqori harorat, ultrabinafsha va ionlashtiruvchi nurlanish, haddan tashqari bosim, og'ir metallarning tuzlari, pH ning yuqori ko'rsatkichlari (kuchli kislotalar va ishqorlar), ba'zi organik birikmalar.

Isitish va har xil nurlanish turlari oqsil tarkibidagi vodorod va ion aloqalarini yo'q qiladi. Kuchli kislotalar, ishqorlar va konsentrlangan tuz eritmalari ion aloqalarini uzadi. Og'ir metallar karboksianionlar bilan kuchli bog'lanishlar hosil qiladi va ionli bog'lanishlarni buzadi. Organik erituvchilar va yuvish vositalari gidrofobik o'zaro ta'sirni buzadi va oqsillarda vodorod aloqalarini buzadi.

Denaturatsiya paytida oqsil tarkibidagi barcha zaif bog'lanishlar o'zgaradi yoki yo'q qilinadi: vodorod, elektrostatik, gidrofobik va boshqalar, ammo peptid bog'lari buzilmasdan qoladi.

Denaturatsiya belgilari:

1) eruvchanlikning o'zgarishi. Suvda erigan oqsil cho'kadi yoki aksincha, erimaydigan oqsil eritmaga tushadi;

2) optik faollikning o'zgarishi, masalan, qutblangan nur tekisligining burilish burchagi;

3) protein globulasi ichida denaturatsiyadan oldin yashiringan yangi reaktiv guruhlarning paydo bo'lishi;

4) denaturatsiyaning asosiy va birinchi belgisi funktsiyani yo'qotishdir. Strukturaviy oqsil bo'shashadi, fermentlar katalitik faolligini yo'qotadi va h.k.

Denatüra qiluvchi moddadan chiqarilgandan so'ng, oqsil asta-sekin asl xususiyatlarini qaytaradi. Ushbu jarayon deyiladi renaturatsiya.

To'qimalarda har bir keyingi O 2 molekulasi oldingisiga qaraganda osonroq ajralib chiqadi, shuningdek protomerlarning konformatsiyasidagi kooperativ o'zgarishlar tufayli.

7. Organik moddalarning katabolizmida hosil bo'lgan CO 2 va H + gemoglobinning konsentratsiyasiga mutanosib ravishda O 2 ga yaqinligini kamaytiradi. Hujayralarning ishlashi uchun zarur bo'lgan energiya asosan mitoxondriyada o'pkadan gemoglobin bilan yuborilgan O 2 yordamida organik moddalarni oksidlanish jarayonida hosil bo'ladi. Organik moddalarning oksidlanishi natijasida ularning parchalanishining yakuniy mahsulotlari: CO 2 va K 2 O hosil bo'ladi, ularning miqdori davom etayotgan oksidlanish jarayonlarining intensivligiga mutanosibdir.

CO 2 hujayralardan diffuziya qonga kiradi va eritrotsitlarga kirib boradi, bu erda karbanhidraz fermenti ta'sirida karbonat kislotaga aylanadi. Ushbu kuchsiz kislota proton va bikarbonat ioniga ajraladi.

H + Uning radikallariga qo'shilishga qodir 14 6 gemoglobinning a- va b-zanjirlarida, ya'ni. gemadan uzoq joylarda. Gemoglobinning protonlashi uning O 2 ga yaqinligini pasaytiradi, oksidning O 2 ni chiqarib tashlashiga, deoksiHb hosil bo'lishiga yordam beradi va hosil bo'lgan proton miqdoriga mutanosib ravishda to'qimalarga kislorod etkazib berishni ko'paytiradi (1.25-rasm).

Eritrotsitlarda H + kontsentratsiyasining oshishiga qarab, bo'shatilgan kislorod miqdorining ko'payishi Bor effekti deb ataladi (bu ta'sirni birinchi bo'lib kashf etgan daniyalik fiziolog Kristian Bor nomi bilan).

O'pkada kislorodning yuqori qisman bosimi uning deoxyHB bilan bog'lanishiga yordam beradi, bu esa oqsilning H + ga yaqinligini pasaytiradi. Uglerod angidraz ta'sirida ajralib chiqqan protonlar CO2 va H 2 O hosil bo'lishi bilan bikarbonatlar bilan o'zaro ta'sir qiladi.