Производство иммунобиологических лекарственных препаратов Производство противобактериальных вакцин и бактериальных антигенов-диагностикумов

Интерфероны

• Интерферон II типа известен как гамма-интерферон (γ-ИНФ). Этот цитокин существенно отличается от двух предыдущих. В целом он проявляет свойства типичного интерлейкина.
• Данный вариант интерферона продуцируется преимущественно Т-хелперами 1 типа. Он активирует различные клеточные популяции, особенно макрофаги, естественные киллеры, стимулирует превращение Тх0 в Тх1, тем самым усиливая воспалительный компонент иммунного ответа.
• Гамма-интерферон усиливает синтез HLA-антигенов клетками, что приводит к ускорению процессов распознавания и внутриклеточной переработки (процессинга) антигенов, стимулирует адгезию лейкоцитов и моноцитов, фагоцитоз, усиливает экспрессию Fc-рецепторов на моноцитах/макрофагах и связывание ими антител.
• К интерферонам III типа относится 3 варианта лямбда-интерферонов и некоторые другие регуляторные молекулы. Они проявляют заметную противовирусную активность.

Получение интерферонов

• В 1978 году для получения 0.1 г чистого интерферона в Центральной лаборатории здравоохранения Хельсинки (лаборатория – мировой лидер по производству интерферона из лейкоцитов здоровых людей) получали при переработке 50 000 л крови.
• В 1980 году Гилберту и Вейссману в США удалось получить интерферон в генетически сконструированной E. coli. Исходная трудность, с которой они столкнулись, – низкий уровень мРНК в лейкоцитах, даже стимулированных заражением вирусом. При переработке 17 л крови удалось выделить мРНК и получить ДНК-копию. Последнюю встроили в плазмиду и клонировали в E. coli. Было испытано свыше 20 000 клонов. Отдельные клоны были способны к синтезу интерферона, но с низким выходом, 1–2 молекулы на клетку.
• В 1980 г. были установлены нуклеотидные последовательности α- и β-интерферонов. После этого химическим синтезом были получены гены α- и β-интерферонов, которые клонировали в E. coli. Вначале к полиакриламидной смоле был присоединен нуклеотид; далее проводили присоединение пар нуклеотидов, используя конденсирующий агент в безводном пиридине. Каждый цикл длился полтора часа, поэтому в течение года можно было синтезировать последовательность длиной в 5000 нуклеотидов. Было синтезировано 67 олигонуклеотидов, которые с помощью лигазы соединили в двунитевую ДНК, состоящую из 514 пар нуклеотидов. Полученный ген встраивали в клетки двух бактерий: E. coli, Methylophilus methylotrophus, и была получена экспрессия.
• В 1л полученной бактериальной суспензии содержится около 5 мг α-IFN, что в 5 тыс. раз больше того количества, которое можно получить из 1л донорской крови.

Стадии получения интерферона
Суспензию лейкоцитарных клеток, выделенных из крови доноров, обрабатывают вирусом, оказывающим индуцирующий эффект на биосинтез IFN (н-р, вирусом Сендай).
Из лейкоцитов получают и-РНК, которая программирует биосинтез интерферона, при этом концентрация и-РНК в индуцированных лейкоцитах не более 0,1%.
С помощью фермента обратной транскриптитазы (ревертазы) на полипептидной основе и-РНК синтезируют комплементарную ей одноцепочечную копию ДНК.
Эукариотический ген в условии in vitro перестраивают, удаляя рестриктазой ту часть нуклеотидов, которая кодирует ненужную информацию.
Созданный ген переносят в плазмиду, где он совмещается с бактериальным промотором, а затем вводится в бактериальную клетку-хозяин.
Существуют другие способы получения интерферона
На основе сконструированных рекомбинантных ДНК, экспрессируемых в клетках E.coli (α, β, α-IFN).
Производство IFN с применением моноклональных антител к соответствующему IFN.
Повышение биосинтеза IFN возможно при введении в эукариотическую дрожжевую клетку вектора, на основе которого сконструирована рекомбинантная молекула ДНК с ионами β и α- интерферонов.
Возможен синтез химическим путем β и α- интерферона.