П. И. Гунькова общая и пищевая микробиология часть I учебное пособие

10
.3. Прямой подсчет количества микроорганизмов 
флуоресцентным методом 
Флуоресцентная микроскопия основана на способности некото-
рых биологических объектов люминесцировать, т.е. светиться при осве-
щении ультрафиолетовым или синим светом вследствие того, что свет 
люминесценции обладает большей длиной волны, чем поглощенный 
(правило Стокса). При этом объекты будут светиться желто-зеленым или 
оранжевым светом. Это собственная или первичная люминесцения. По-
скольку большинство микроорганизмов не обладает собственной люми-
несценцией, существует несколько способов их обработки для наблюде-
ния в люминесцентном микроскопе. Прежде всего это окрашивание их 
специальными красителями флуорохромами – сильно разбавленными 
растворами флуоресцирующих красителей. Из синтетических флуоро-
хромов наилучшие результаты дают акридин желтый или оранжевый, 
корифосфин, примулин, родамин. Такой вид люминесцении в отличие 
от первичной носит название наведенной (вторичной). 
Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычной поз-
воляет: 
• сочетать цветное изображение и контрастность объектов; 
• исследовать как прозрачные, так и непрозрачные живые
объекты; 

---

86
• изучать морфологию как живых, так и мертвых клеток мик-
роорганизмов; 
• исследовать клеточные микроструктуры, избирательно по-
глощающие различные флуорохромы, и определять функционально-
морфологические изменения клеток; 
• исследовать различные жизненные процессы в динамике их 
развития. 
Микробные клетки окрашивают акридиновым оранжевым 
и концентрируют их на фильтрах методом центрифугирования или 
фильтрования. В проходящем свете с длиной волны 450 нм живые 
бактерии светятся зеленым светом, а мертвые – оранжево-красным. 
Подсчет численности бактериальных клеток в ходе микроскопирова-
ния ведется одновременно по отдельным морфологическим призна-
кам, что дает возможность охарактеризовать как состав сообщества, 
так и общую численность микроорганизмов (кл/см
3
) в исследуемом 
объекте.
Люминесцентная микроскопия широко используется в меди-
цинской микробиологии для диагностики возбудителей туберкулеза, 
дифтерии, гонореи, возвратного тифа и др. 
Разработан ГОСТ Р 52415–2005 Молоко натуральное коровье – 
сырое. Люминесцентный метод определения количества мезофиль-
ных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов.
В настоящее время для исследований применяют следующие 
модели люминесцентных микроскопов, выпускаемых отечественной 
промышленностью: ЛЮМАМ З–8, МЛД–2, ЕС БИМАМ Р–11, 
ЕС БИМАМ Р–13. 
К главным недостаткам люминесцентной микроскопии отно-
сятся низкое разрешение при подсчете мелких бактериальных клеток 
(размером менее 1 мкм) и, следовательно, пропуск их большей части, 
большое напряжение зрения при подсчете мелких клеток, а также 
затемненные условия микроскопирования.