|
12
XIV Съезд Русского ботанического общества
(NucleiExtractionBuffer) по протоколу производителя в пластиковых чашках Петри. Инкубирование
образцов проводили при комнатной температуре в течение 2 мин.
Образцы фильтровали через одноразовый фильтр Cellecrics Partec 50 мкм (Германия, Sysmex
Partec) и добавляли 2 мл раствора Staining Solution для окрашивания, содержащего Staining Buffer
(Германия, Sysmex Partec), йодид пропидия (50 мкг/мл) и RNAse A (50 мкг/мл). Инкубирование
(окрашивание) проводили при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение 40 ми-
нут. Подготовленные образцы хранили в холодильнике не более 4 часов. Для каждого образца наби-
рали 15000 событий (при необходимом количестве от 5000 до 20000).
Относительное содержание ядерной ДНК (2С) рассчитывали исходя из линейной зависимости
между флюорисцентными сигналами от окрашенных ядер исследованных образцов и внутреннего
стандарта.
Проведено 5 вариантов опыта в 3 повторностях:
1. Семя
N. schoberi
+ листья стандартного образца
Raphanus sativus
«Saxa»
32
с добавлением
поливинилпиролидона (МВ ~29000) (США, Sigma-Aldrich) в экстрагирующий буфер;
2. Аналогичный опыт без добавления поливинилпиролидона;
3. Листья стандартного образца
Raphanus sativus
«Saxa»
32
в присутствии поливинилпироли-
дона;
4. Аналогичный опыт без добавления поливинилпиролидона;
5. Листья
N. schoberi
+ листья стандартного образца
Raphanus sativus
«Saxa»
32
с добавлением
поливинилпиролидона в экстрагирующий буфер.
Были установлены различия значений 2С, полученные для семян
N. schoberi
с добавлением
антиоксиданта поливинилпиролидона и без него – результаты, полученные без добавления, получи-
лись больше в среднем в 1,1 (3,31 пг и 3,63 пг, соответственно). Это связано с тем, что без добавления
поливинилпиролидона происходит снижение флюоресценции ядер, выделенных из листьев стандарт-
ного образца – наблюдается сдвиг пика на 2,5 канала влево по 256-канальной шкале. Аналогичные
различия в интенсивности флюоресценции ядер выявлены при анализе только листьев стандартного
образца
Raphanus sativus
«Saxa»
32
без добавления и в присутствии поливинилпиролидона. Интенсив-
ность флюоресценции ядер, выделенных из семян
N. schoberi,
не меняется под действием антиокси-
данта. Обнаруженные особенности свидетельствуют о наличии ингибиторов окрашивания ядер в ли-
стьях стандартного образца
Raphanus sativus
«Saxa»
32
и их отсутствии в семенах
N. schoberi.
В вариантах с листьями
N. schoberi
, после экстракции ядер буфером (Nuclei Extraction Buffer),
образцы становились вязкими и плохо фильтровались через мембранный фильтр, что также свиде-
тельствует о присутствии в них вторичных метаболитов. Для анализа относительного содержания
ДНК в листьях
N. schoberi
необходимо обязательное добавление антиоксиданта.
В результате исследования установлена стабильность относительного содержания ДНК
N. schoberi
на эндогенном уровне (в листьях одного растения) – 3,40–3,41 пг и вариабельность на
внутри- и межпопуляционном уровнях – в опытах с использованием листьев получено среднее для
трех популяций значение относительного содержания ДНК – 3,24±0,069 пг, в опытах с семенами из
этих же популяций – 3,28±0,055 пг.
Показано, что семена
N. schoberi
являются удобным материалом для исследования содержа-
ния ядерной ДНК методом FCM, поскольку не содержат ингибиторов окрашивания, при этом у них
отсутствует эндосперм, они легко транспортируются и хорошо хранятся.
Список литературы
Doležel J., Sgorbati S., Lucretti S. 1992. Comparison of three DNA fluorochromes for flow cytomet-
ric estimation of nuclear DNA contrent in plants // Physiol. Plant. № 85. P. 625–631.
Greilhuber J. 2008. Cytochemistry and C-values: the less-well-known world of nuclear DNA
amounts // Annals of Botany. Vol. 101, № 6. P. 791–804.
Loureiro J., Rodriguez E., Doležel J., Santos C. 2006. Flow cytometric and microscopic analysis of
the effect of tannic acid on plant nuclei and estimation of DNA content // Annals of Botany. Vol. 98, № 3. Р.
515–527.
Do'stlaringiz bilan baham: |
