|
Gel elektroforezi.
Bu usulda etalon muhit sifatida kraxmal, agar, poliakrilamid jellari ishlatiladi.Kraxmalli gel elektroforezi birinchi elektroforetik usul bo'lib, unda moddalarni ajratishni yaxshilash uchun molekulyar elakning xususiyatlariga ega bo'lgan muhit ishlatilgan. Bu usul 1955 yilda taklif qilingan. Kraxmal suvda erimaydigan polisaxariddir. O'zining tabiiy holatida u bir oz suvni bog'laydi va shishiradi, lekin harorat ko'tarilganda suyuqlikka aylana olmaydi. Qisman kislota gidrolizi natijasida kraxmal 700C dan yuqori haroratda suyuq eritmaga va xona haroratida qattiq gidrogelga aylanishi mumkin. Kartoshka kraxmal elektroforez uchun juda mos keladi. Jeldagi teshiklarning kattaligi kraxmal konsentratsiyasi va uning gidrolizlanish darajasi bilan belgilanadi. Kraxmal gellari strukturaviy va fiziologik faol oqsillarning murakkab aralashmalarini ajratishda eng katta dasturni topdi. Shunday qilib, qon zardobidagi oqsillarni ajratishda 20-30 ta bandni olish mumkin.
Elektroforezda tashuvchi sifatida ishlatiladigan agar turli suv o'tlarining hujayra membranalaridan ajratiladi. Alohida preparatlarning tozaligi va kimyoviy tarkibi tayyorlash manbasiga va tozalash usuliga qarab sezilarli darajada farq qiladi. Agarning aniq tuzilishi noma'lum. U, ehtimol, kamida ikkita polisakkaridni o'z ichiga oladi, ya'ni agaroz va agaropektin. Agar qaynayotgan suv hammomida qizdirilganda suvli eritmalarda eriydi, 380C da qotib qoladi. Agar gel mexanik jihatdan kuchli. Quritgandan so'ng u shaffof plyonkaga aylanadi, bu optik usullar bilan fotometriya uchun qulay va saqlash uchun qulay. Bundan tashqari, agar-agar ham zaharli bo'lmagan materialdir. Agar va ayniqsa agaroza biokimyoda elektroforezda yordamchi vosita sifatida, asosan, makromolekulalarni o'rganish uchun keng qo'llaniladi. Agar jeli ko'p miqdorda suvni o'z ichiga oladi (geldagi agaroz va agaropektin konsentratsiyasi atigi 1% ni tashkil qiladi), buning natijasida elektroforez paytida ionlar juda tez harakat qiladi. Bu xossasi tufayli agar antijenlarni immunoelektroforez bilan ajratish va aniqlash uchun juda qulaydir.
Gel elektroforezining ko'rib chiqilayotgan variantlarining umumiy kamchiliklari elektroendoosmoz (qog'ozdagidan kamroq bo'lsa ham) va jellarni tayyorlash uchun ishlatiladigan nostandart materiallarning mavjudligi.Yuqorida sanab o'tilgan jellarning eng istiqbollisi poliakrilamid jeldir (PAAG). Poliakrilamid jellari biologik amaliyotga 1959 yilda Raymond tomonidan kiritilgan. Ular kraxmal va agar jellariga xos bo'lgan kamchiliklardan mahrum.
PAAGda elektroforez hozirgi vaqtda mavjud usullarning eng samaralisi bo'lib, biologiyaning turli sohalarida keng qo'llaniladi. Bu usul boshqa jellardan foydalanadigan usullarga qaraganda yuqori aniqlikka ega. Poliakrilamid jeli shaffof, sezilarli mexanik kuchga ega, tarkibi bir hil va kimyoviy jihatdan inertdir. PAAG ning g'ovak o'lchami keng diapazonda o'zgarishi mumkin, uni turli xil tamponlar bilan ishlatish mumkin, ajratilgan moddalarni miqdoriy aniqlash uchun foydalanish qulay.
Poliakrilamid geli akrilamid va metilenbisakrilamidni polimerizatsiya qilish yo'li bilan ishdan oldin darhol olinadi.Bunday holda, akrilamidning chiziqli qismlari metilenbisakrilamidning ko'ndalang ko'prigi bilan "birga tikilgan" tarmoq strukturasining polimeri paydo bo'ladi. Metilenbisakrilamid kontsentratsiyasi qanchalik yuqori bo'lsa, jelning tarmoq tuzilishi zichroq bo'ladi. Polimerizatsiya tashabbuskor sifatida tetrametiletilendiamin (TEMED) va katalizator sifatida ammoniy yoki kaliy persulfat ishtirokida amalga oshiriladi. Monomerlar nisbatini o'zgartirib, uch o'lchovli tuzilishga ega bo'lgan hosil bo'lgan polimer hujayralarining hajmini nazorat qilish mumkin. 2 dan 30% gacha bo'lgan monomer konsentratsiyasi 40 dan 0,1 nm gacha bo'lgan g'ovaklikka ega jellarni olish imkonini beradi. Poliakrilamid jeli turli konsentratsiyali va kichik hajmdagi (0,001 ml gacha) eritmalarni o'rganish, sovutishdan foydalanish va ajratishni juda tez - 60-70 minut ichida amalga oshirish imkonini beradi.
Poliakrilamid gelida makromolekulalar ajratilganda adsorbsiya va elektroosmoz past bo'ladi. Poliakrilamid jeli 270 nm ultrabinafsha nurni o'zlashtirmaydi va shuning uchun ajratilgandan keyin oqsillarning joylashishini ushbu to'lqin uzunligidagi yutilishdan aniqlash mumkin. Va nihoyat, molekulalarni ajratgandan so'ng, ularni bo'yash va moddaning miqdorini optik zichlikni o'lchaydigan densitometr yordamida aniqlash mumkin.
Poliakrilamid gelda (vertikal va gorizontal, quvurlar va plitalarda) elektroforez uchun ko'plab variantlar mavjud. Boshqalarga qaraganda tez-tez vertikal elektroforez usuli qo'llaniladi. U poliakrilamid jellarning ikkita tizimini birlashtiradi: katta gözenekli (yuqori gel) va nozik gözenekli (pastki gel). Yuqori jelda hujayrali materialning ajralishi va oqsillarning siqilishi sodir bo'ladi. Proteinlarni ajratish pastki jelda sodir bo'ladi.
Do'stlaringiz bilan baham: |
