Oqsillarning gel-elektroforezi

Disk-elektroforez

Bu uslubda oqsillarning elektr maydonida harkatlanishi va fraksiyalarga ajrashi PAG bilan to‗lg‗azilgan silindrsimon shisha naychalarda amalga oshiriladi. Kolonkada oqsil fraksiyalari disk ko‗rinishida ajraladi, shu sababli disk— elektroforez deb nomlangan.
Asbobning tuzilishi. Disk — elektroforez o‗tkaziladigan asboboning asosiy qismi yuqori (1 rasm) va pastki idishdan, gel to‗ldiriladigan shisha naychalardan (1—rasm) iborat. YUqori va pastki idishga platina simli yoki ko‗mir plastikali elektrod (1— rasm) o‗rnatilgan. Ikkala idish o‗rtasida gel to‗ldiriltan shisha naychalar vertikal holatda joylashadi. YUqorigi idishning tubida bir xil uzoqlikda joylashgan teshiklar bo‗lib, mahkamlovchi xalqa (1—rasm) yordamida gelli naycha biriktiriladi. SHisha naychaning ichki diametri 5 mm, tashqi diametri 7 mm, naycha uzunligi 65 — 70 mm. Naychaning ichki yuzasi bir tekis bo‗lishi lozim, aks holda oqsillar aniq fraksiyalarga ajralmaydi va gelni shishadan ajratib olish qiyinlashadi.
Akrilamid gelning yaxshi polimerlanishiga shisha naychaning tozaligi ham ta‘sir qiladi, shuning uchun ishlatishdan avval shisha naychalarni xrom aralashmasida bir soat bo‗ktirib qo‗yib, suvda chayiladi va termostatda quritiladi. YOg‗dan tozalash uchun atsetonga botirib olib, yana quritiladi.

1—rasm. Disk — elektroforez o‘tkazish uchun mo‘ljallangan asbob

1 — asbobning bufer to‗ldirilgan yuqori qismi, 2 — asbobning bufer to‗ldirilgan pastki qismi, 3 —gelli shisha naycha,

4. 
   — elektrodlar,
   
5. 
   — mahkamlovchi xalqa,
   
6. 
   —shisha naycha o‗rnatiladigan teshik.
   

Elektroforez o‗tkazish, uchun kerakli asbob va reaktivlar: elektroforez asbobi, mikropipetka, shprits, shisha naycha uchun shtativ, fotopolimerlash uchun lampa, elektr toki manbai, biriktiruvchi simlar, tris, akrilamid, TEMED, NS1, BIS, riboflavin, saharoza, ammoniy persulfat, glitsin yoki (alanin),
bromfenol ko‗ki (metilen yashili), toza sirka kislotasi, KON kerak bo‗ladi. Eritma tayyorlash. Gel tayyorlash uchun asosiy eritmalar.
Nordon oqsillar uchun:
A ishqoriy eritma: (rN8,9) 48,0 ml I N NS1
36,6 g tris
0,23 ml- TEMED 100 ml gacha distillangan suv bilan keltiriladi;
48,0 ml I N NS1
5,98 g tris
0,46 ml TEMED
100 ml gacha distillangan suv solinadi;
28,0 g akrilamid
0,75 g BIS
100 ml gacha distillangan suv solinadi; 10 g akrilamid
2,6 g BIS
100 ml gacha distillangan suv solinadi; 400 mg riboflavin
100 ml gacha distillangan suv solinadi;
40 g saharoza
100 ml gacha distillangan suv solinadi;
0,14 g ammoniy persulfat 100 ml gacha distillangan suv solinadi; 6,0 g tris
28,8g glitsin
1000,0 ml gacha distillangan suv solinadi. Ishlatishdan avval 10 marta suyultirilishi lozim!
Indikator — bo‗yovchi eritma; 0,001 g bromfenol ko‗ki 100 ml gacha distillangan suv solinadi.
Fiksirlovchi —bo‗yovchi eritma; 1 g maid qorasi 10 V
100 ml gacha 7%-lisirkakislotasi solinadi.
Ajratuvchi – quyultiruvchi eritma; 1000 ml 7%-li sirka kislotasi Ishqoriy oqsillar uchun
A nordon eritma; 5,8 ml I N KON
(rN 4,3) 17,2 ml toza sirka kislotasi 4,0 ml TEMED
100 ml gacha distillangan suvsolinadi.
V nordon eritma; 48,0 ml I N KON
(rN 7,8) 2,87 ml toza sirka kislotasi 0,48 ml TEMED
100 ml gacha distillangan suvsolinadi. S nordon eritma; 60 g akrilamid 0,4 g BIS
100 ml gacha distillangan suvsolinadi. E nordon eritma; 4 mg riboflavin 100 ml gacha distillangan suvsolinadi. G‗ nordon etirma; 40 g saharoza 100 ml gacha distillangan suvsolinadi.
K nordon eritma; 0,28 g ammoniy persulfat 100 ml gacha distillangan suvsolinadi.
Elektrod buferi eritmasi 31,2 g β-alanin rNq4,5 ; 8,0 ml toza sirka kislota 1000,0 mlgacha distillangan suv solinadi.
Ishlatishdan avval 10 marta suyultirilishi lozim. Indikator — bo‗yovchilari: 0,1 g metilen yashili 100 mlgacha distillangan suv solinadi.
Ajratuvchi — quyultiruvchi eritma va fiksirlovchi — bo‗yovchi eritmalar ishqoriy oqsillar uchun berilganidek qilib tayyorlanadi.
«K» eritmadan tashqari barcha eritmalarni muzlatkichda saqlash mumkin. «K» eritma bevosita ishlitishdan oldin tayyorlanadi.
Ishning borishi: 1. Muzlatkichda saqlangan eritmalar xona haroratiga keltirildi.

2. 
   SHisha naychalar gelni polimerlash uchun mo‗ljallangan shtativga o‗rnatiladi.
   
3. 
   Pastki gel manomerini tayyorlash uchun asosiy eritma quyidagi nisbatda olinadi:
   

1. 
   hajm A eritma
   
2. 
   hajm S eritma
   

1 hajm dist. suv
4 hajm K eritma
Vakuum nasos yordamida eritma havosi tortib olinadi, aks holda eritma tarkibidagi havo gelni mo‗rtlashtiradi va polimerlanish jarayoni bir tekis bormaydi. Eritmalar yuqoridagi nisbatda olinganda ishqoriy muhit uchun 7%-li (rN 8,9), nordon muhit uchun 15%-li (rN 4,3) gel hosil bo‗ladi.

2. 
   SHisha naychalarga 1,2—1,5 ml ajratuvchi gel monomer eritmasidan quyiladi. Gelning sirti tekis qotishi uchun monomer eritma ustiga 0,1 — 0,2 ml distillangan suv extiyotlik bilan shisha naycha devori orqali quyiladi, bunda monomer va distillangan suv ajralib ketmasligi kerak.
   
3. 
   Polimerlanish 30 minut davom yetadi. Bu jarayon tugaganligini suv bilan monomer gel o‗rtasida hosil bo‗lgan aniq chegaradan bilish mumkin.
   

b. Asosiy eritmalardan quyultiruvchi gel monomeri tayyorlanadi. Buning uchun: nordon oqsillar uchun ishqoriy oqsillar uchun

1. 
   hajm V eritma V eritma
   
2. 
   hajm D eritma G‗ eritma
   

1 hajm E eritma S eritma
4 hajm G‗ eritma E eritma
Qotgan pastki gelning sirti quyultiruvchi gel eritmasi bilan chayib olinadi.

7. 
   Ajratuvchi gel ustiga 0,1—0,15 ml quyultiruvchi gel eritmasi quyiladi.
   
8. 
   SHisha naychalar joylangan shtativ 260 — 500 Vt-li ultrabinafsha lampasi ostiga qo‗yiladi. Riboflavin ishtirokida boradigan fotopolimerlanish jarayoni 15 — 20 minut davom yetadi. Polimerlanish jarayoni tugaganligani sarg‗ish — yashil eritmaning xiralashishidan, gel bilan suv o‗rtasida hosil bo‗lgan aniq chegaradan bilish mumkin.
   
9. 
   Polimerlanish jarayoni tugagach gel ustidagi distillangan suv filtr qog‗ozyordamida olib tashlanadi.
   
10. 
    Oqsil eritmasini tayyorlash. Oqsil eritmasi buferga diffuziyalanib ketmasligini ta‘minlash uchun, ajratilmoqchi bo‗lgan oqsilni 8 marta suyultirilgan A eritmasida eritiladi. Oson diffuziyalanadigan, molekulyar og‗irligi kichik bo‗lgan oqsillarni saharoza eritmasida eritiladi.
    
11. 
    SHisha naycha asbobga o‗rnatilib gel ustiga 0,10 — 0,25 ml oqsil eritmasi quyiladi. Naychaning bo‗sh qolgan qismi elektrod buferi yordamida, oqsil eritma bilan aralashib ketmasligini ta‘minlagan holda to‗ldiriladi.
    
12. 
    Pastki idishga — 4° S gacha sovutilgan bufer eritma solib, yuqori va pastki idishlar birlashtiriladi. YUqoridagi idishga ham extiyotlik bilan sovuq bufer va 1—2 ml indikator bo‗yog‗i qo‗shiladi. Asbob muzlatkichga o‗rnatiladi va polyarligi bo‗yicha tok manbaiga ulanadi. Dastlabki yarim soatda har bir shisha naychaga
    

2 mA-dan tok kuchi berilishi kerak. Bu vaqtda elektrokimyoviy konsentrlanish jarayoni boradi, agar birdaniga katta tok kuchi berilsa issiqlik ta‘sirida
broun harakati kuchayib, oqsil bufer eritmaga chiqib ketishi mumkin. Oqsil molekulalari konsentrlovchi geldan o‗tib ajratuvchi gel chegarasi etib kelganda, tok kuchi har bir naycha uchun 5 mAgacha oshiriladi.

7. 
   Elektoroforez tugaganligini indikator bo‗yog‗i shisha naychaning pastki chegarasiga etib kelganidan bilish mumkin.
   
8. 
   Elektroforez tugagach shisha naychalar asbobdan chiqarib olinadi.
   
9. 
   Naychadan gelni ajratib olish uchun suv to‗lg‗azilgan shpritsdan foydalaniladi. Buning uchun naycha va gel orasiga shprits ninasini spiralsimon yo‗nalishda aylantirib suv yuboriladi. SHunda gel asta tashqariga chiqadi.
   
10. 
    Gel fiksirlovchi bo‗yoqda I soat ushlanadi.
    
11. 
    Bo‗yalgan gel bir necha marta distillangan suv bilan chayqaladi va ajratuvchi eritmaga solinadi. Bu jarayon geldan ajratuvchi eritmaga bo‗yoq chiqmaydigan bo‗lguncha davom ettiriladi. YUvish jarayoni tugaganligini gelniig oqsilli fraksiyalari bo‗yalib, oqsil bo‗lmagan qismining rangsizlannishidan bilish mumkin.
    
12. 
    Gelni uzoq muddat saqlash lozim bo‗lsa gel shisha plastinka ustida xona haroratida quritiladi. Quruq gelni bir necha yillab saqlasa bo‗ladi. Quruq gel ajratuvchi eritmada 24 soat ushlansa u yana o‗z holiga keladi.