Oqsil va peptidlarning kimyoviy tuzilishni aniqlashda zamonaviy sekvеnatorlarning ishlash prinsiplarini o’zlashtirish

Suyuq fazali sekvenatorda aniqlash.Oqsillar tuzilishini aniqlashdagi yirik kashfiyot bu P.Edman va J.Begg tomonidan yaratilgan aminokislota qoldiqlarini N-oxirgi uchini Edman usuli bo’yicha yuqori samaradorlik bilan ketma-ket parchalovchi qurilma-sekvenatordir

Sekvenatorda barcha reaksiyalar inert gaz atmosferasida doimiy tezilik bilan aylanuvchi silindrik shisha stakanda amalga oshiriladi. Tekshirilayotgan oqsil namunasi stakan devorlariga nozik qatlam tarzida beriladi,r eaktiv va erituvchilar shlang orqali stakan tubiga uzatiladi. Markazdan qochuvchi kuch hisobiga ular devor bo’yicha ko’tarilib, oqsil bilan ta’sirlashadilar va stakanni yuqori qismidagi maxsus chuqurchada to’planib shlang orqali chiqib ketadilar. Ikki faza o’rtasidagi ta’sirlanishni katta sirti reagentlarni oqsil qatlami orqali osongina kirishini ta’minlaydi va reaksiyalarni tezlik bilan borishini hamda reaksiya mahsulotlarini ekstraktsiyasiga to’sqinlik qilmaydi. Sekvenatorda tekshirilayotgan oqsilni havo kislorodi bilan ta’sirlanishi mumkin emas va reaksiyalarni barcha bosqichlarini borishi standartlashtirilgan. Ishlatiladigan reagent va erituvchilarni izchil tozalash natijasida aminokislota qodiqlarini parchalanishini avtomatik ravishda 95 va undan yuqorigacha olib borish mumkin. Reagentlarni uchuvchanligini oldini olish uchun reaksion stakanni katta hajmiga birikish reaksiyalarida asos sifatida kvadrol ( -tetrakis-2-gidroksipropil)-etilendiamin; ajralish reaksiyalarida esa quyi uchuvchanlikka ega geptaftormoy kislota qo’shiladi.

Sekvenatorda Edman reaksiyasini ikki bosqichi birikish va ajralish amalga oshiriladi.

Hosil bo’lgan anilinotiazolinonlar ekstraktsiya qilib olinadilar va fraksiyalar kollektoridan yig’iladi. Ularning FTG larga aylanishi qo’lda yoki avtomatik ravishda amalga oshiradigan-konverterda amalga oshiriladi(5-rasm). Suyuq fazali sekvenator o’z tarkibida 60-200 aminokislota qoldiqlariga ega oqsil va peptidlarni aniqlashda yaxshi natijalar ko’rsatadi. Bular uchun odatda 30-50 dan iborat ketma-ketlik aniqlanadi. Yirikroq oqsillarni aniqlashda degradatsiyalanish jarayonida polipeptid zanjirini ichidagi labil peptid bog’larini sezilarli gidrolizi amalga oshadi. Ikkinchi tomondan, qisqa peptidlar, ayniqsa o’z tarkibida gidrofob aminokislotalarga ega peptidlar sekvenator stakanidan intensiv yuviladi.

Peptidlarni bunday yo’qotishni oldini olish uchun reaktsion kameraga peptidni mexanik yo’qolishiga to’sqinlik qiluvchi maxsus tashuvchilar qo’shiladi.Tashuvchi sifatida erkin α-aminoguruhga ega emas oqsillar(masalan, sitoxrom C) yoki sintetik polimerlar poliornitin va polibren ishlatiladi.

Peptidlarni organik erituvchilarda eruvchanligi ularni gidrofilligi ortgan sari keskin kamayadi. Gidrofillikni oshirish uchun fenilizotiotsianatlarni analoglari hisoblangan Braunitser reagentlaridan foydalaniladi. Edman bo’yicha degradatsiyalanishdan birinchi bosqichda FITS o’rniga Brauniser reagenti qo’shilsa, ε-aminoguruhlarini modifitsirlanishi hisobiga lizinli peptidlarni gidrofilligi keskin ortadi, bu esa ularni sekvenatorda aniqlashga imkon beradi.

2.