Mustaqil ish mavzu: G

SAMARQAND DAVLAT UNIVERSITETI
BIOLOGIYA FAKULTETI, BIOTEXNOLOGIYA YO’NALISHI

MUSTAQIL ISH



Mavzu: Gibridomalar texnologiyasi


Bajardi: 215-guruh talabasi
R.Asadullayeva
Samarqand_2022

GIBRIDOMALAR TEXNOLOGIYASI

Gibridoma texnologiyasi bir xil sonli sonlarni ishlab chiqarish usuli antikorlar (shuningdek, deyiladi monoklonal antikorlar). Ushbu jarayon sichqonchani (yoki boshqa sutemizuvchini) an bilan ukol qilishdan boshlanadi antigen bu immunitetga javob beradi. Oq qon hujayralarining bir turi B xujayrasi, AOK qilingan antigen bilan bog'lanadigan antikorlarni ishlab chiqaradi. B-hujayralarni ishlab chiqaradigan ushbu antikorlar sichqonchadan olinadi va o'z navbatida birlashtirilgan o'lmas B hujayrasi saraton hujayralari bilan, a miyeloma,[tushuntirish kerak] gibrid ishlab chiqarish hujayra chizig'i deb nomlangan gibridoma, bu B hujayrasining antikor ishlab chiqarish qobiliyatiga va miyelomning uzoq umr ko'rish va ko'payish qobiliyatiga ega. Gibridomalar madaniy sharoitda o'stirilishi mumkin, har bir madaniyat bir xil hayotiy gibridoma hujayrasidan boshlanib, madaniyati har biri turli xil antikorlar (poliklonal) aralashmalari emas, balki bitta madaniyat uchun bitta antikor (monoklonal) ishlab chiqaradigan genetik jihatdan bir xil gibridomalardan iborat. Ushbu jarayonda ishlatiladigan miyeloma hujayralari chizig'i o'sish qobiliyati uchun tanlangan to'qima madaniyati va antikor sintezi yo'qligi uchun. Aksincha poliklonal antikorlar, bu juda ko'p turli xil antikor molekulalarining aralashmalari, har bir gibridoma chizig'i tomonidan ishlab chiqarilgan monoklonal antikorlarning barchasi kimyoviy jihatdan bir xil.

Monoklonal antikorlarni ishlab chiqarish uchun ishlatiladigan gibridoma usulining umumiy vakili.
Usul
(1) Sichqonni emlash
(2) B hujayralarini taloqdan ajratib olish
(3) Miyeloma hujayralarini etishtirish
(4) Miyeloma va B hujayralarining birlashishi
(5) Hujayra chiziqlarini ajratish
(6) Tegishli katakchalarni skrining qilish
(7) in vitro (a) yoki jonli ravishda (b) ko'paytirish
(8) O'rim-yig'im
BTX Garvard Apparatus, Holliston MA AQSh tomonidan ishlab chiqarilgan vaktsinani kuchaytirish uchun Agile Pulse In Vivo Electroporation System
BTX ECM 2001 Gibridoma ishlab chiqarish uchun elektrofuziya generatori
To'qimalar madaniyatida o'sadigan gibridoma hujayralari. Rasmda bitta hujayralar klonlari ko'rsatilgan bo'lib, ularning har biri ko'p miqdordagi o'ziga xos monoklonal antikor ishlab chiqaradi, ular hujayralar ajratadi va ularni madaniy muhitdan osongina tozalash mumkin.
Laboratoriya hayvonlari (sutemizuvchilar, masalan. sichqonlar) birinchi navbatda antitel yaratilishi kerak bo'lgan antigenga ta'sir qiladi. Odatda bu bir necha hafta davomida ko'rib chiqilayotgan antijenni bir qator in'ektsiyalari bilan amalga oshiriladi. Ushbu in'ektsiyalardan keyin odatda in vivo jonli ravishda foydalaniladi elektroporatsiya, bu immunitet reaktsiyasini sezilarli darajada yaxshilaydi. Bir marta splenotsitlar sutemizuvchilardan ajratilgan taloq, B hujayralari abadiylashgan miyeloma hujayralari bilan birlashtirilgan. B hujayralarining miyeloma hujayralari bilan birlashishi elektrofüzyon yordamida amalga oshirilishi mumkin. Elektrofuziya B hujayralari va miyeloma hujayralarining elektr maydonini qo'llash bilan birlashishiga va birlashishiga olib keladi. Shu bilan bir qatorda, B-hujayralar va miyelomalar ko'pincha kimyoviy protokollar yordamida birlashishi mumkin polietilen glikol. Miyeloma hujayralari antikorni o'zlari ajratmasligini va ularning etishmasligini ta'minlash uchun oldindan tanlanadi gipoksantin-guanin fosforiboziltransferaza (HGPRT) geni, ularni sezgir qiladi Shlyapa vositasi (pastga qarang).
Birlashtirilgan hujayralar HAT muhitida inkubatsiya qilinadi (gipoksantin-aminopterin-timidin o'rtacha) taxminan 10 dan 14 kungacha. Aminopterin nukleotid sintezini ta'minlaydigan yo'lni to'sadi. Demak, eritilmagan miyeloma hujayralari nobud bo'ladi, chunki ular tomonidan nukleotidlar hosil qila olmaydi de novo yoki qutqarish yo'llari chunki ularga HGPRT etishmayapti. Eritilmagan miyeloma hujayralarini olib tashlash kerak, chunki ular boshqa hujayralardan, ayniqsa kuchsiz shakllangan gibridomalardan kattalashish imkoniyatiga ega. Birlashtirilmagan B hujayralari o'ladi, chunki ular qisqa umr ko'rishadi. Shu tarzda, faqat B hujayra-miyeloma duragaylari omon qoladi, chunki B hujayralaridan chiqqan HGPRT geni funktsionaldir. Ushbu hujayralar antikorlar ishlab chiqaradi (B hujayralarining xususiyati) va o'lmas (miyeloma hujayralarining xususiyati). Keyin inkubatsiya qilingan muhit ko'p quduqli plitalarga suyultiriladi, shunda har bir quduqda faqat bitta hujayradan iborat bo'ladi. Quduqdagi antikorlar bir xil B hujayrasi tomonidan ishlab chiqarilganligi sababli, ular bir xil epitopga yo'naltiriladi va shu bilan monoklonal antikorlardir.
Keyingi bosqich - tezkor birlamchi skrining jarayoni bo'lib, u faqat o'ziga xos o'ziga xos antitellarni ishlab chiqaradigan gibridomalarni aniqlaydi va tanlaydi. Amaldagi birinchi skrining texnikasi deyiladi Elishay. Keyin gibridoma kulturasi o'ta yuqori darajali, ikkilamchi fermentli konjugat va xromogen substrat inkubatsiya qilinadi va rangli mahsulot shakllanishi ijobiy gibridomani ko'rsatadi. Shu bilan bir qatorda, immunotsitokimyoviy,[2] Western blot va immunoprecipitatsiya-mass-spektrometriya skriningidan ham foydalanish mumkin. G'arbiy blot-tahlillardan farqli o'laroq, immunoprecipitatsiya-mass-spektrometriya antigen oqsillarining mahalliy (denaturatsiyalanmagan) shakllari bilan bog'langan klonlarni skrining va reytingini osonlashtiradi.[3]
Kerakli antikorlarni ishlab chiqaradigan B hujayrasi klonlanib, ko'plab bir xil qiz klonlarini hosil qilishi mumkin. Qo'shimcha vositalarni o'z ichiga oladi interleykin-6 (kabi briklon) ushbu qadam uchun juda muhimdir. Gibridoma koloniyasi tashkil etilgandan so'ng, u doimo RPMI-1640 (antibiotiklar va homila qoramol zardobida) kabi muhitda o'sib boradi va antitellar hosil qiladi.[2]
Multiwell plitalari dastlab gibridomalarni o'stirish uchun ishlatiladi va tanlanganidan keyin kattaroq to'qima kolbalari bilan almashtiriladi. Bu gibridomalarning farovonligini saqlaydi va keyingi tekshiruvlar uchun kriyoprezervatsiya va o'ta yuqori darajadagi hujayralarni ta'minlaydi. Kultivatsiya supernatantidan 1 dan 60 mkg / ml gacha bo'lgan monoklonal antikor hosil bo'lishi mumkin, u zarur bo'lganda -20 ° C yoki undan past darajada saqlanadi.[2]
Kultivatsiya supernatantidan yoki tozalangan immunoglobulin preparatidan foydalanib, potentsial monoklonal antikorni ishlab chiqaruvchi gibridomani keyingi tahlil qilish reaktivlik, o'ziga xoslik va o'zaro reaktivlik nuqtai nazaridan amalga oshirilishi mumkin.[2]
Monoklonal antikorlardan foydalanish juda ko'p va kasallikning oldini olish, diagnostika va davolashni o'z ichiga oladi. Masalan, monoklonal antikorlar B hujayralari va T hujayralari, bu har xil turlarini aniqlashda yordam beradi leykemiya. Bundan tashqari, aniqlash uchun o'ziga xos monoklonal antikorlar ishlatilgan hujayra yuzasi markerlari kuni oq qon hujayralari va boshqa hujayralar turlari. Bu sabab bo'ldi farqlash klasteri qator markerlar. Ular ko'pincha CD-markerlar deb ataladi va ularning har biri ma'lum bir monoklonal antikorni bog'lash bilan belgilanadigan bir necha yuz hujayralar yuzasining turli xil tarkibiy qismlarini aniqlaydi. Bunday antikorlar juda foydali lyuminestsentsiya bilan faollashtirilgan hujayralarni saralash, ma'lum turdagi hujayralarni o'ziga xos izolyatsiyasi.

Diagnostik gistopatologiyada

Monoklonal antikorlar yordamida to'qima va organlarni to'qima yoki hujayra genezisini aks ettiruvchi ma'lum belgilangan markerlarni ko'rsatishi asosida tasniflash mumkin. Prostata o'ziga xos antijeni, platsenta ishqoriy fosfataza, inson xorionik gonadotrofini, a-fetoprotein va boshqalar organlar bilan bog'liq antijenlerdir va bu antigenlarga qarshi monoklonal antikorlarni ishlab chiqarish birlamchi o'smaning xarakterini aniqlashga yordam beradi
Monoklonal antikorlar, ayniqsa, morfologik o'xshash lezyonlarni farqlashda juda muhimdir plevra va peritoneal mezotelyoma, adenokarsinomava farqlanmagan organ yoki to'qima kelib chiqishini aniqlashda metastazlar. Tanlangan monoklonal antikorlar aniqlashda yordam beradi yashirin metastazlar (birlamchi kelib chiqishi noma'lum bo'lgan saraton) suyak iligi, boshqa to'qima aspiratlari, shuningdek limfa tugunlari va boshqa to'qimalarni immuno-sitologik tahlil qilish orqali va odatdagidan sezgirlikni oshirishi mumkin. histopatologik binoni.[2]
Bitta ish[4] bo'yicha sezgir immuno-histokimyoviy tahlil o'tkazdi ilik mahalliy prostata saratoni bilan kasallangan 20 bemorning aspiratlari. Tahlilda epiteliya hujayralari tomonidan ifoda etilgan membrana va sitoskeletal antigenlarni aniqlashga qodir bo'lgan uchta monoklonal antikor (T16, C26 va AE-1) ishlatilgan. Lokalizatsiya qilingan prostata saratoni bilan kasallangan bemorlarning 22% (B bosqichi, 0/5; C bosqichi, 2/4) va metastatik prostata saratoni bilan kasallangan 36% bemorlarning suyak iligi aspiratlari (D1 bosqichi, 0/7 bemorlar; D2 bosqichi, 4 / 4 bemor) suyak iligida antigen-musbat hujayralar bo'lgan. Suyak iligi aspiratlarining immuno-gistokimyoviy bo'yalishi prostata bezi saratoni aniqlangan bemorlarda yashirin suyak iligi metastazlarini aniqlash uchun juda foydali degan xulosaga kelishdi.
Shish bilan bog'liq bo'lgan monoklonal antikorlardan foydalangan holda immuno-sitokimyada yashirinlikni aniqlash qobiliyati yaxshilanganiga qaramay ko'krak bezi saratoni suyak iligi aspiratlari va periferik qon tarkibidagi hujayralar, uni muntazam ravishda ishlatishdan oldin ushbu usulni yanada rivojlantirish zarur.[5] Immuno-sitokimyoning muhim kamchiliklaridan biri shundaki, faqat o'smaga bog'liq bo'lgan va o'ziga xos bo'lmagan monoklonal antikorlardan foydalaniladi va natijada normal hujayralar bilan o'zaro reaktsiya paydo bo'lishi mumkin.[6]
Ko'krak bezi saratonini samarali tarzda bosqichma-bosqich o'tkazish va ildiz hujayralarini autolog infuzion qilishdan oldin tozalash rejimlarining samaradorligini baholash uchun, hatto kichik miqdordagi ko'krak bezi saratoni hujayralarini aniqlash muhim ahamiyatga ega. Buning uchun immuno-gistokimyoviy usullar juda mos keladi, chunki ular sodda, sezgir va o'ziga xosdir. Franklin va boshq.[7] suyak iligi va periferik qonda ko'krak o'simta hujayralarini aniqlash uchun o'simta hujayrasi yuzasi glikoproteinlariga qarshi to'rtta monoklonal antikorlarning (260F9, 520C9, 317G5 va BrE-3) birikmasi yordamida sezgir immuno-sitokimyoviy tahlil o'tkazdi. Ular natijalarga ko'ra suyak iligining immuno-sitokimyoviy ranglanishi va periferik qon ko'krak bezi saraton hujayralarini aniqlash va miqdorini aniqlashning sezgir va sodda usulidir.
Buning asosiy sabablaridan biri metastatik relaps bo'lgan bemorlarda qattiq o'smalar malign hujayralarning erta tarqalishi. Sitokeratinlarga xos bo'lgan monoklonal antikorlardan (mAb) foydalanish suyak iligidagi tarqalgan individual epiteliy o'simta hujayralarini aniqlashi mumkin.
Bitta ish[8] sitokeratin komponentini bir vaqtning o'zida etiketlash uchun immuno-sitokimyoviy protsedura ishlab chiqilganligi to'g'risida hisobotlar. 18 (CK18) va prostata o'ziga xos antijeni (PSA). Bu prostata saratoni bilan og'rigan bemorlarda tarqalgan epiteliya o'simta hujayralarini keyingi tavsiflashda yordam beradi. Prostatitning benign gipertrofiyasi bo'lgan bemorlarning o'n ikki nazorat aspirati salbiy binoni ko'rsatdi, bu esa suyak iligidagi epiteliya o'simta hujayralarini aniqlashda CK18 ning o'ziga xosligini qo'llab-quvvatlaydi.
Efuziya bilan murakkablashgan xavfli kasalliklarning aksariyat hollarda, neoplastik hujayralar osongina tanib olish mumkin. Biroq, ba'zi hollarda, malign hujayralar juda oson ko'rinmaydi yoki ularning mavjudligi uni ijobiy hisobot deb atash uchun juda shubhali. Immuno-sitokimyoviy usullardan foydalanish ushbu holatlarda diagnostika aniqligini oshiradi.
Ghosh, Meyson va Spriggs[9] zararli kasallikka chalingan 41 bemorning plevra yoki qorin parda suyuqligining 53 namunasini tahlil qildi. An'anaviy sitologik tekshiruvda neoplastik hujayralar aniqlanmagan. Xavfli hujayralarni izlash uchun uchta monoklonal antikor (anti-CEA, Ca 1 va HMFG-2) ishlatilgan. Immunotsitokimyoviy yorliq 18 oygacha -20 ° C darajasida saqlanib qolgan, bo'yalgan smearlarda o'tkazildi. Immuno-sitokimyoviy binoni qilingan qirq bitta holatning o'n ikkitasida malign hujayralar aniqlandi. Natijada o'sishni anglatadi diagnostika aniqligi taxminan 20%. Tadqiqot xulosasiga ko'ra, xavfli xastalikka shubha qilingan bemorlarda sitologik jihatdan salbiy namunalarni tekshirishda immuno-sitokimyoviy yorliqdan muntazam foydalanish kerak va bemorni boshqarish borasida muhim ta'sir ko'rsatmoqda.
Immuno-sitokimyoviy bo'yashning yana bir tatbiqi - bitta smearda ikkita antijenni aniqlash. Yengil zanjirli antikorlar va T va B hujayralari markerlari bilan ikki marta bo'yash limfomaning neoplastik kelib chiqishini ko'rsatishi mumkin.[10]
Bir tadqiqotda monoklonal antikor (IgM, k izotipi) ishlab chiqaradigan gibridoma hujayra liniyasining (klon 1E10) ajratilishi haqida xabar berilgan. Ushbu monoklonal antikor nukleollarning o'ziga xos immuno-sitokimyoviy bo'yashini ko'rsatadi.[11]
Monoklonal antikorlar yordamida to'qimalarni va o'smalarni ma'lum markerlarning ifodalanishi asosida tasniflash mumkin. Ular morfologik jihatdan o'xshash lezyonlarni ajratishda va differentsiyalanmagan metastazlarning organ yoki to'qima kelib chiqishini aniqlashda yordam beradi. Tanlangan monoklonal antikorlar bilan suyak iligi, to'qima aspiratlari, limfa tugunlari va boshqalarni immuno-sitologik tahlil qilish yashirin metastazlarni aniqlashga yordam beradi. Monoklonal antikorlar hatto oz miqdordagi invaziv yoki metastatik hujayralarni aniqlashda sezgirlikni oshiradi. Sitokeratinlarga xos bo'lgan monoklonal antikorlar (mAbs) suyak iligidagi tarqalgan epiteliy o'simta hujayralarini aniqlashi mumkin.