Microsoft Word Conf-селекция rtf

 
ESKIMO 1 ГЕН в RNAi ВЕКТОРНОЙ КОНСТРУКЦИИ и ТРАНСФОРМАЦИЯ КУЛЬТУРЫ 
КЛЕТОК ХЛОПЧАТНИКА 
 
Бабаджанова Ф.И., Шапулатов У.М., Мирзаахмедов М.Х., Убайдуллаева Х.А., Ларина Л.А.,
Буриев З.Т., Абдурахмoнов И.Ю. 
Центр геномики и биоинформатики АН РУз 
Одним из ценных сельскохозяйственных культур для нашей страны является хлопчатник. 
Улучшение его агрономических свойств чрезвычайно важно для экономики Республики. Как известно 
засоленность почвы и засуха виновны в значительнов снижении урожайности различных сельхозкультур 
по всему миру. Площадь заселенных земель очень большая (примерно 10
9
гектаров) и она быстро 
расширяется в силу увеличивающейся ирригации, развития сельского хозяйства в засушливых зонах и 
глобального потепления. Кроме того, большинство орошаемых земель в Центральной Азии включая 
Узбекистан, склонны к естественному засолению и страдают от вторичного засоления [1]. 
В связи с этим, повышение устойчивости сельхозкультур к засоленности почв, засухе и другим 
стрессовым факторам становится важной задачей для фермеров и селекционеров, потому что это 
необходимо для достижения устойчивого производства сельхозкультур с использованием доступных в 
настоящее время земельных ресурсов. Одним из инновационных подходов для устойчивого сельхоз 
производства (включая хлопчатник) является создание засухо- и солеустойчивых сортов и обеспечение их 
ускоренной коммерциализации. 
В получении улучшенных и устойчивых сортов сельскохозяйственных культур (в том числе и 
хлопчатник) в последнее время активно используются современные биотехнологические методы. 
Необходимыми этапами таких методов является создание специальные векторные конструкции, 
трансформация ими растительных клеток, отбор эмбрионов и последующий соматический эмбриогенез. 
В этом контексте, характеристика генов/локусов, ответственных за устойчивость к стрессу, 
является необходимым условием эффективного переноса этих генов с помощью молекулярных маркеров 
и инструментов трансгеномики. 
Благодаря современным исследованиям выявлены гены, функционирующие в условиях 
стрессовых факторов засухи, холода и засоленности. Bouchabke-Coussa и коллеги в 2008 году методом 
анализа мутантных линий выявили участие гена ESKIMO1 в таких стрессах, как засуха, холод и 
засоленность [2]. Ранее, о мутации в гене ESKIMO1 сообщалось как о мутации приводившей к 
устойчивости к замерзанию без акклиматизации к холоду [3]. Наши работы запланированы в направлении 
клонирования ортологов ESKIMO1 в хлопчатнике и РНК интерференция функции гена. Это наиболее 

---

279
подходящий методом для верификации функции гена и обеспечения засухо- и солеустойчивости у 
используемой нами сельхозкультуры.
Наши исследования и экспериментальные работы основаны на важной роли малых и микро РНК в 
биологических процессах, протекающих в живых организмах. Практически все нормальные и патогенные 
клеточные процессы, в какой-то точке метаболизма управляются этими маленькими элементами. В 
мировой литературе омечено, что микроРНК растений негативно регулируют свои гены-мишени во время 
ответа на стресс [4]. Исследование профиля малых и микро РНК хлопчатника у засухо- и солеустойчивых 
генотипов в сравнении с неустойчивыми генотипами в условиях стресса приведет к обнаружению 
кандидатных малых/микроРНК, которые вносят вклад в устойчивость к стрессам у хлопчатника. 
Целью данной работы было использование RNAi вектора для конструкций c геном eskimo 1, 
которую в последующем использовали для трансформации клеток хлопчатника. 
В процессе исследований выполняли выделение тотальной РНК и фракции малых РНК из тканей 
проростков устойчивых и не устойчивых к засолению генотипов хлопчатника, подвергнутых солевому 
стрессу. Тотальная РНК выделена с помощью набора для выделения РНК компании Ambion (США). 
Малые РНК разделялись на фракции разного размера при помощи фракционатора flash PAGE (Ambion, 
США). Выделенная РНК была подвергнута электрофорезу в 15% денатурирующем полиакриламидном 
геле. Фракция малых РНК размером в 20-25 нуклеотидов была вырезана из геля и очищена для 
клонирования с помощью протокола аденилированного линкера. 
Трансформация арабидопсиса и хлопчатника была проведена при помощи метода Clough and Bent 
[5]. Синтетические векторы были перенесены в Agrobacterium штамм LBA4404 и использованы для in 
vitro трансформации гипокотилей хлопчатника.
Существует различные RNAi векторные конструкции. Одной из наиболее эффективных 
конструкций является pHellsGate, которая позволяет использовать сайт- специфическую рекомбинацию. 
Для этого нами были клонированы ортологи гена eskimo1 у хлопчатника (Gossypium hirsutum L.). 
Мы выполнили дизайн и создали векторные конструкции для генов eskimo-1 арабидопсиса (pHG-8_EskAt) 
и хлопчатника (pHG-8_EskTM1). Кроме того, в качестве контроля была создана конструкция, включающая 
нуклеотидные последовательности гена GFP (pHG-8_GFP). 
Вышеописанные генетические конструкции были трансформированы в клетки агробактерии 
Agrobacterium tumefaciens штамма LBA4404 общепринятым методом heat-shock. 
Векторные конструкции c геном eskimo 1 pHG-8_EskAt, pHG-8_EskTM1 и pHG-8_GFP были 
использованы для трансформации клеток хлопчатника и были получены трансгенные эмбриоды.