Маъруза мавзуси 8-мавзу: молекуляр клонлаш. Лигирлаш реакцияси. Компонент хужайраларни тайёрлаш ва трансформация қилиш

pTZ57R|T плазмид таркибидаги фрагментни ПЗР-амплификацияси учун ишлатиладиган праймерлар (астарлар)

Праймерлар номи	Нуклеотидлар кетма-кетлиги 5’^3’
pUC/M13 Forward	CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
pUC/M13 Reverse	TCACACAGGAAACAGCTATGAC

ПЗР-амплификацияси тугагандан сўнг, намуналарни 2% агароза гелида электрофорез ёрдамида таҳлил қилинг.

Мисол сифатида 8.1-расмда битта намунадаги колонияларнинг ПЗР- скрининги кўрсатилган.
Кейинги ишлар бизда қизиқиш уйғотадиган рекомбинант плазмидларни ўз ичига олган ПЗРни мусбат колониялари билан олиб борилади.
Бактерияларни 15 мл пробиркага таркибида ампициллин (100 мг/мл концентрацияда) бўлган 5 мл муҳитда киритилади ва инкубаторда 14-16 соат давомида 37 ° C да кучли аралаштириш билан инкубация қилинади.

8.1 - расм. E. coli колонияларини ПЗР-скрининг натижаларини 2% агароза гели электрофорез ёрдамида таҳлил қилиш.

1 - ижобий назорат (pTZ57R|T плазмидига киритилган COI мтДНК генининг бир бўлаги), 2-6 - таҳлил қилинган колониялар, К – ПЗР-амплификацияси маҳсулоти векторлари қўшмасдан, М - ДНК маркери (DNA Lader Mix).


Бактериал штаммларни узоқ муддатли сақлаш:
E. coli ҳужайраларини икки ҳафтадан кўпроқ вақт давомида + 4° C ҳароратда сақлаш тавсия этилмайди, колонияларни тез-тез қайта экиш тавсия этилмайди, чунки бу рекомбинант плазмидларнинг генетик беқарорлигига олиб келади ва ўз-ўзидан пайдо бўлган мутациялар эҳтимолини оширади. Паст ҳароратларда (-12° C дан -80° C гача) узоқ муддатли сақлаш учун ҳужайраларга криоротектор (глицерин) қўшилади, бу ҳужайра ичида муз кристалларининг пайдо бўлишига имкон бермайди.
E. coli бактериал културасини узоқ муддатли сақлаш учун тайёрлаш:
Намунани криоконсервация қилиш учун ("дренажлаш" ни тайёрлаш) тоза пробиркага (ҳажми 1,5 мл), 0,5 мл стерил 80% глицеринни 0,5 мл бактериялар културасига қўшинг. Вортексда аралаштиринг. Музлатинг ва - 80 ° C ҳароратда сақланг.