Лекция 4. Дифференциальные, препаративные и другие методы центрифугирования
Подготовила: Атажанова Ш.М
План:
Гомогенизация.
Ультрацентрифугирование.
Экстракция.
Аналитические методы.
Методика выделения веществ из биологического материала.
1. Методы разрушение клеток
(гомогенизация)
Образование различных веществ в ходе периодического роста Clostridium acetobutylicum при рН 5; приведены экспериментально найденные концентрации клеточной массы, масляной кислоты, бутанола.
Способы разрушения клеток
Способ
Пример
Принцип
Мягкое воздействие
Лизис клеток
Эритроциты
Осмотическое разрушение клеточной мембраны
Разрушение под действием ферментов
Обработка бактерий лизоцимом
Разрушение клеточной стенки приводит к осмотическому разрыву клеточной мембраны
Химическая солюбилизация и автолиз
Экстракция дрожжей толуолом
Клеточная стенка (мембрана) частично растворяется под действием химических веществ, освободившиеся при этом литические ферменты завершают процесс
Способ
Пример
Принцип
Мягкое воздействие
Гомогенизация вручную
Ткань печени
Клетки продавливают через узкий зазор, что приводит к разрушению клеточной мембраны
Размельчение (растирание)
Мышечная ткань и др.
Клетки разрушаются в процессе размельчения ткани под действием силы сдвига
1 – корпус с электродвигателем и пусковым устройством;
2 – камера для измельчеия материала
Application volumes 0.05 - 250 ml
Manual Disperser
Applications
General homogenization applications (dispersion and emulsification)
Homogenising of tumour tissue sample, for research of diverse tissue diseases
Fast dissolving of pills, sugar-coated tablets for quality control purposes
Sample preparation for subsequent extraction of pharmaceutical agents
Cell disruption, RNA / DNA isolation from tissue
Dispersion of small quantities from plants, animals or human tissue
Solving of solid materials
Механический лопастной гомогенизатор
ШАРОВАЯ МЕЛЬНИЦА
3D гомогенизаторы
Технология основана на растирающем действии лизирующих частиц при 3D-движениях вибрационного ротора. Высокоэффективный принцип позволяет гомогенизировать и лизировать образец любой сложности в считанные секунды.
3D гомогенизаторы
Ультразвуковой дезинтегратор
Cell suspension
Ultrasound
generator
Ultrasound tip
Ячейка пресса Френча
Ячейка пресса Френча
Пресс Френча
1. Ткани животных
Ткань разрезают на кусочки, удаляют, насколько это возможно, соединительную ткань и жир. Разрезанную ткань помешают в лопастной гомогенизатор, добавляют 2-3 объема холодного экстрагирующего буфера в расчете на 1 г ткани. Смесь гомогенизируют в течение 30 с; гомогенизацию повторяют, если остались куски неразрушенной ткани. При доведении рН до нужного значения перемешивают гомогенат 10-15 мин, а затем переносят его в центрифужные пробирки и центрифугируют при 5000-10000g 60 мин.
Экстракт сливают через фильтр, марлю или стеклянную вату для удаления частиц жира.
2. Эритроциты
Экстракт можно легко получить из осажденных центрифугированием эритроцитов после промывания их изотоническим раствором NaCl (0,9%, 0,15 М). Клетки разрушают осмотическим шоком в воде (2 объема на воды на 1 объем отцентрифугированных клеток).
Некоторые примеры
3. Мягкие растительные ткани
К растительной ткани добавляют только 0,5-1 объем холодного буфера, содержащего 20‑30 мМ меркаптоэтанола. и гомогенизируют в лопастном гомогенизаторе в течение 30 с. Вместо этого можно пропустить материал через бытовую соковыжималку или натереть на терке. Гомогенат следует отцентрифугировать как можно скорее, чтобы уменьшить его потемнение в результата окисления. Жидкость осторожно сливают с поверхности осадка.
4. Дрожжи
1. Полностью разрушить клетки можно с помощью гомогенизатора Мэнтона-Гаулина, используя около двух объемов буфера на 1 г сырой массы.
2. Автолиз толуолом. Применяют различные методы с использованием толуола. В основе этих методов лежит обработка дрожжей толуолом, обычно при температуре 35-40°С. Через 20-30 мин дрожжи "разжижаются" вследствие экстракции компонентов клеточной стенки. После этого к дрожжам добавляют буфер и перемешивают их в течение нескольких часов или оставляют на ночь на холоде. Так как метод автолитический и структуры клеточной стенки разрушаются под действием ферментов, во время обработки может произойти деградация некоторых клеточных белков.
5. Бактерии
Бактериальные клетки можно разрушить ультразвуком, с помощью шаровой мельницы или пресса Френча, хотя не все эти способы удобны для приготовления больших объемов экстракта. В случае небольших объемов клетки можно растирать с окисью алюминия.
Грамположительные бактерии обычно чувствительны к лизоциму. (Bacillus). Грамотрицательные бактерии, если их предварительно не обрабатывать, менее чувствительны к лизоциму (E. coli).
Извлечение мембранных белков
При извлечении белков связанных с мембранами эффективным является применение детергентов. Часто для этой цели используется мягкий неионный детергент Тритон Х-100. Детергенты способны растворить клеточную мембрану и солюбилизировать белок сохранив при этом его целостность.
2. Ультрацентрифугирование (седиментация)
Ультрацентрифугирование
Седиментация – осаждение частиц в жидкости или газе под действием силы тяжести или центробежной силы.
Если седиментация осуществляется с использованием высокоскоростной центрифуги (ультрацентрифуги), используется термин ультрацентрифугирование.
Метод позволяет:
- определить Мr, плотность и форму макромолекул,
- разделить смесь веществ на компоненты для аналитических и препаративных целей
Ультрацентрифугирование
Принцип метода
При центрифугировании раствора макромолекул частицы движутся к дну пробирки под действием центробежных сил. Через определенные промежутки времени определяют распределение частиц по длине пробирки.
Ультрацентрифугирование
Методы ультрацентрифугирования
Скоростное ультрацентрифугирование – частицы движутся через раствор, оставляя за собой зону чистого растворителя. Исследуют смещение границы между растворителем и раствором.
Зональное ультрацентрифугирование – образец наносится в виде слоя на поверхность более плотного растворителя. Различные компоненты будут разделяться в виде серии зон (полос), которые осаждаются только через растворитель отдельно одна от другой.
Ультрацентрифугирование
Теория ультрацентрифугирования
На молекулу в растворе при центрифугировании действуют следующие силы:
Ультрацентрифугирование
Теория ультрацентрифугирования
1. Частица с большей массой будет двигаться быстрее
2. Более плотная частица (с меньшим объемом) будет двигаться быстрее, чем менее плотная
4. Чем больше коэффициент трения, тем медленнее движение частиц
Ультрацентрифугирование
Теория ультрацентрифугирования
Коэффициент седиментации
параметры
эксперимента
параметры молекулы
Ультрацентрифугирование
Аналитическая ультрацентрифуга
Оборудование для ультрацентрифугирования
Ультрацентрифугирование
Препаративная ультрацентрифуга
Оборудование для ультрацентрифугирования
Ультрацентрифугирование
Ротор с подвесными
стаканами
Ротор с подвесными
стаканами
Угловой ротор
Оборудование для ультрацентрифугирования
Ультрацентрифугирование
Скоростное ультрацентрифугирование
Скоростное ультрацентрифугирование – частицы движутся через раствор, оставляя за собой зону чистого растворителя. Исследуют смещение границы между растворителем и раствором.
Ультрацентрифугирование
Оптические методы регистрации движения границы раствор – чистый растворитель
Шлиреновская система
основана на том, что луч света не отклоняется при прохождении через область с однородной концентрацией, но отклоняется, проходя через участок с изменяющейся концентрацией, вследствие изменения показателя преломления.
Ультрацентрифугирование
Оптические методы регистрации движения границы раствор – чистый растворитель
Интерференционная система
использует двухсекторную ячейку, один из секторов которой содержит только растворитель, другой – раствор. При прохождении света через оба сектора получается оптическая интерферен-ционная картина.
Ультрацентрифугирование
Оптические методы регистрации движения границы раствор – чистый растворитель
Абсорбционная система
регистрирует поглощение света определенной длины волны, соответствующей максимуму поглощения исследуемых биомолекул, по длине ячейки.
Ультрацентрифугирование
Скоростное ультрацентрифугирование
Определение коэффициента седиментации
Ультрацентрифугирование
Скоростное ультрацентрифугирование
Определение коэффициента седиментации
tg = w2s
tg = 3,62 *10-5 с-1
W = 2* 33000 /60
= 3,45*103 рад/с
W2 = 1,19*107
S = 30,1 *10-13 с
Ультрацентрифугирование
Скоростное ультрацентрифугирование
Факторы, влияющие на величину коэффициента седиментации
1. Чем больше концентрация, тем больше S.
2. Чем больше скорость вращения центрифуги, тем больше S.
3. Заряженные частицы имеют меньший S, чем незаряженные.
4. Частицы с вытянутой формой проявляют меньший S.
5. Чем больше Mr, тем больше S.
Ультрацентрифугирование
Скоростное ультрацентрифугирование
Ультрацентрифугирование
Скоростное ультрацентрифугирование
Определение коэффициента седиментации
Ультрацентрифугирование
Зональное ультрацентрифугирование
Проводят в градиенте плотности сахарозы или глицерина 5-20 % (белки), либо в градиенте плотности CsCl (ДНК)
D – коэффициент распределения извлекаемого вещества между органической и водной фазой в процессе равновесия
α – коэффициент извлечения, показывающий какая часть извлекаемого вещества перешла в органическую фазу
αобщий = α(1+(1-α)+(1-α)²+…)
Достичь лучших результатов можно путем многократной экстракции, добавляя каждый раз минимальный объем растворителя, чтобы концентрация извлекаемого вещества в нем была наибольшей.
4
1
2
3
4
1.Добавление в исходную смесь растворителя – экстрагента.
Слой экстрагента вверху, водный слой внизу.
2.Взбалтывание смеси. Происходит перераспределение
частиц между фазами.
3.Спустя некоторое время начинается расслаивание. Вверху
слой экстрагента с выделившимся веществом, внизу водный
органические вещества, молекулы которых способны к образованию координационных связей (донорно-акцепторного типа) с извлекаемым ионом, более прочных, чем связи молекул воды, то есть условие протекания процесса экстракции будет выглядеть так: энергия сольватации молекулами экстрагента превышает энергию гидратации
органические кислоты и основания и их соли или способные при контакте с водным раствором к обмену катиона или аниона, входящего
в состав экстрагента, на катион или анион, находящийся в р-ре Условием протекания экстракции является более высокая энергия гидратации ионов, переходящих из органической фазы в водную, по сравнению с извлекаемыми из водного раствора ионами
6
Для того, чтобы прошел процесс экстракции экстрагент должен подчиняться следующим требованиям:
1.Не смешиваться с водой.
2.Быть селективным.
3.Максимально отличаться по плотности по отношению к воде.
4.Иметь большую емкость по отношению к извлекаемому веществу.
5.Иметь минимальную вязкость.
6.Иметь низкую стоимость.
7.Быть не взрывоопасным веществом.
С2H5OH
(CH3)2C=O
(CH3)2O
(CH3)2S=O
(С4H9O)3P=O
(CH3)2NH
(C2H5)3N
Для экстракции используются различные растворители
7
В лаборатории экстракцию проводят в
специальной лабораторной
посуде – делительной воронке. Они
бывают различных видов, например,
грушевидной и цилиндрической. Если
необходимо провести непрерывную
экстракцию, то выбирают экстракторы.
Делительные воронки состоят из сосуда,
сверху которого шлифованное горло для
заливания экстрагируемой смеси с
растворителем. Снизу имеется кран,
который можно регулировать для
сливания расслоившихся фаз.
8
экстрагирование вещества из твердой фазы отдельными порциями растворителя при нагревании
это простая экстракция, при которой вещество из твердой фазы многократно извлекают отдельными порциями растворителя при комнатной температуре
вид экстракции, при котором вещество из твердой фазы экстрагируют растворителем противоточным методом при комнатной температуре
извлечение вещества из раствора непрерывно циркулирующим растворителем. Противоточная перфорация осуществляется при использовании противотока.
На границе твердой и жидкой фаз при обычных видах экстракции равновесие практически не наступает. Чтобы максимально приблизиться к его достижению, используют измельчение веществ, перемешивание и противоток.
9
РАЗОВАЯ
ЭКСТРАКЦИЯ
НЕПРЕРЫВНАЯ
ЭКСТРАКЦИЯ
Разовая экстракция может быть как однократной (т.е. проводится один раз), так и многократной (проводиться два и более количество раз), если это необходимо.
Такой вид процесса экстракции также называют перколяцией. Она проводится в более сложных аппаратах, которые называются экстракторами (например, таких как аппарат Сокслета).
1. Якорь магнитной мешалки 2. Колба для кипячения экстрагента 3. Трубка для паров растворителя 4. Патрон из пористого материала 5. Сухая смесь 6. Сифон 7. Слив сифона 8. Шлифовой переходник 9. Обратный холодильник 10, 11. Патрубки для холодной воды
В круглодонной колбе нагревается растворитель, его пары проходят вверх и конденсируются с помощью холодильника в гильзу аппарата. Как только уровень жидкости в гильзе достигает верхний уровень сифона, гильза опустошается: раствор вещества сливается в исходную колбу и цикл повторяется.
ПОДАЧА ВОДЫ
ВЫХОД ВОДЫ
10
КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ ВЕЩЕСТВ
МЕТОД РАЗДЕЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ
ВЫДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
ВЫДЕЛЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ
11
Настойки – окрашенные спиртовые или водно -
спиртовые извлечения из лекарственного растительного
сырья, получаемые экстракцией.
К измельченному лекарственному растительному сырью прибавляют объем воды или спирта и выдерживают на кипящей водяной бане при нагревании (для настоек 15 мин, для отваров 30 мин). Далее охлаждают, отфильтровывают и получают фильтрат, который при необходимости растворяют водой.
