Курсовая работа кинетика ферментативных реакций

1.4 Образование кинетически устойчивого комплекса фермент – продукт

Если в ходе реакции происходит образование кинетически устойчивого комплекса фермент – продукт, механизм реакции выглядит следующим образом:

Применив предположение о стационарном состоянии, можно написать дифференциальные уравнения:

d [ES] /dt = k₁ [E] [S] + k_-2 [EP] – (k_-1 + k₂) [ES] = 0

d [EP] /dt = k₂ [ES] – (k_-2 + k₃) [EP] = 0

Из этих уравнений следует, что

[ES] = [(k_-2 + k₃) / k₂] [EP]

[E] = [(k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃) / k₁k₂ [S]] [EP]

Так как v = k₃ [EP]

и [E]_T = [E] + [ES] + [EP] =

= [(k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃) / k₁k₂ [S] + (k_-2 + k₃) / k₂ + 1] [EP] =
= {[k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃ + k₁ [S] (k_-2 + k₃) + k₁k₂ [S]] / k₁k₂ [S]} [EP]

получаем

[EP] = k₁k₂[S] [E]_T / [k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃ + k₁ [S] (k_-2 + k₃ + k₂)]
v = k₁k₂k₃[S] [E]_T / [k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃ + k₁ [S] (k_-2 + k₃ + k₂)] =
= [k₂k₃ / (k_-2 + k₃ + k₂)] [E]_T[S] / [(k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃) / k₁ (k_-2 + k₃ + k₂) + [S]]

То есть

V_max = [k₂k₃ / (k_-2 + k₃ + k₂)] [E]_T
K_m = (k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃) / k₁ (k_-2 + k₃ + k₂)

В этом случае уже очень сложно вычислить конкретные значения индивидуальных констант скорости, так как прямо измерить можно только их отношение. Ситуация еще более затрудняется при усложнении механизма ферментативной реакции, когда в реакции участвуют больше двух комплексов, потому что количество констант скорости в уравнении, естественно, гораздо больше, и их соотношения также сложнее. [2]

Однако ситуация упрощается, если после обратимой реакции образования первого комплекса последующие элементарные стадии необратимы. Важными представителями ферментов, подчиняющихся этому механизму, являются протеолитические ферменты и эстеразы. Механизм их реакции можно записать следующим образом:

где ES` – ацилферментное промежуточное соединение, которое разлагается под действием воды. Мы можем написать

d [P₂] /dt = d [P₁] / dt = v = k₁k₂k₃ [S] [E]₀ / [k₃(k_-1 + k₂) + [S] (k₂ + k₃)]

V_max = k₂k₃ [E]₀ / (k₂ + k₃) = k_кат [E]₀
K_m = k₃ (k_-1 + k₂) / (k₂ + k₃) k₁
k_кат / K_m = k₂k₁ / (k_-1 + k₂) = k₂ / K_m’
Константа Михаэлиса стадии ацилирования – K_m' K_s. Чем больше отношение k_кат/K_m, тем выше специфичность субстрата. [5]
Определение констант значительно упрощается, если эксперимент проводят в присутствии нуклеофильного агента (N), способного конкурировать с водой. Тогда

k₃ = k₃’ [H₂O] и P_i (i = 1, 2, 3) – продукты.

v_i = k_{кат, i} [E₀] [S] / (K_m + [S])
k_{кат, 1} = k₂ (k₃ + k₄ [N]) / (k₂ + k₃ + k₄ [N])
k_{кат, 2} = k₂k₃ / (k₂ + k₃ + k₄ [N])
k_{кат, 3} = k₂k₄ [N] / (k₂ + k₃ + k₄ [N])
K_m = K_s (k₃ + k₄ [N]) / (k₂ + k₃ + k₄ [N])
1/v_N = K_s (k₃ + k₄ [N]) / k₂k₃ [S] [E₀] + (k₂ + k₃ + k₄ [N]) / k₂k₃ [E₀]

Так как известно, что K_s/k₂ = K_m/ k_кат, и если нуклеофил отсутствует, то

1/v = K_s / k₂ [S] [E₀] + (k₂ + k₃) / k₂k₃ [E₀]

и для определения констант можно использовать точку пересечения прямых в координатах 1/v_N (и 1/v) – 1/[S]. Две прямые линии в двойных обратных координатах пересекаются во втором квадранте. В отсутствии нуклеофила точка пересечения прямой с вертикальной осью определяется как 1/V_max и 1/k_кат[E₀], а с горизонтальной осью – как -1/K_m. Координаты точки пересечения двух прямых: -1/K_s и 1/k₃[E₀]. Расстояние между 1/V_max и 1/k₃[E₀] равно 1/k₂[E₀].

1.5 Анализ полной кинетической кривой реакции

Уравнение Михаэлиса – Ментен в исходном виде относится только к необратимым реакциям, т.е. к реакциям, где рассматривается только начальная скорость, а обратная реакция не проявляется из-за недостаточного количества продукта и не влияет на скорость реакции. В случае необратимой реакции полную кинетическую кривую можно легко анализировать (для произвольного интервала времени t), интегрируя исходное уравнение Михаэлиса – Ментен. В этом случае, следовательно, сохраняется предположение, что в ходе реакции образуется только один промежуточный фермент-субстратный комплекс. Так как для интервала времени t не ставится никаких ограничений, концентрация субстрата в момент анализа не может быть равной первоначально введенной его концентрации. Таким образом, также необходимо принимать во внимание изменение [S] в ходе реакции. Пусть S₀ – начальная концентрация субстрата, (S₀ – y) – концентрация в момент времени t. Тогда, на основе исходного уравнения Михаэлиса – Ментен (если y – количество превращенного субстрата), мы можем написать

dy / dt = V_max (S₀ – y) / (K_m +S₀ – y)

Взяв обратные величины и разделив переменные, интегрируем по y в пределах от 0 до y (V_max обозначена как V):

(2,303 / t) lg [S₀ / (S₀ - y)] = V / K_m – (1 / K_m) (y / t)

Таким образом, построив график зависимости левой части уравнения от y/t (координаты Фостера-Ниманна), получим прямую линию с наклоном (-1/K_m), отсекающую на оси ординат отрезок (V/K_m), а на оси абсцисс – отрезок V. Интегральное уравнение можно также линеаризовать по-другому:

t / 2,3031 lg [S₀ / (S₀ – y)] = y / 2,303 V lg [S₀ / (S₀ – y)] + K_m / V

или t/y = 2,3031 K_m lg [S₀ / (S₀ – y)] / V_y +1/V [5]

Если мы изучаем обратимую реакцию, необходимо обращать внимание на то, с каким временным интервалом мы имеем дело. В момент смешения фермента с субстратом начинается так называемая предстационарная фаза продолжительностью несколько микро- или миллисекунд, в течение которой образуются фермент-субстратные комплексы, соответствующие стационарному состоянию. При изучении обратимых реакций на достаточно протяженных отрезках времени эта фаза не играет значительной роли, так как в этой фазе реакция не протекает с полной скоростью ни в одном из направлений.

Для реакции, идущей слева направо, фермент-субстратные комплексы, принимающие участие в реакции, достигают скоростьлимитирующей концентрации только в конце предстационарной фазы. Квазистационарное состояние, в котором концентрации скоростьопределяющих фермент-субстратных комплексов приближаются к максимальным значениям концентраций в стационарном состоянии, длится несколько десятых долей секунды или секунды. Во время этой фазы скорость образования продукта (или расходования субстрата) практически линейная во времени. Теоретически здесь образования продукта еще не произошло, а практически его концентрация настолько мала, что скорость обратной реакции не влияет на скорость прямой. Эта линейная фаза называется начальной скоростью реакции, до сих пор мы только ее и принимали во внимание. [3]
Реакция справа налево в следующей фазе также ускоряется из-за постепенного увеличения концентрации продукта (переходное состояние; наблюдаемая до сих пор линейность во времени исчезает). Эта фаза продолжается до тех пор, пока скорость реакции слева направо не становится равной скорости реакции справа налево. Это – состояние динамического равновесия, так как реакция непрерывно продолжается в обоих направлениях с одинаковой скоростью.