Kichik plazmidalar, bakteriofaglar va kasmidalardan yot genlarni klonlashda vektor sifatida foydalanish

1 – rasm. Spora hosil qiluvchi ichak tayoqchasimon bakteriyalar hujayralariga spora ko’rinib turibdi (1000 marta kattalashtirib ko’rsatilgan) (Federov M.V.dan olingan).

Bu tadqiqotlar genetik injeneriya rivojlanishidagi eng birinchi qadam bo’lib, genetik manipullsiyalar uchun asosiy material tayyorlashni ko’zda tutgan. Bu tadqiqotlarda genetik informatsiyani tirik hujayraga kiritish masalasi ustida mutlaqo izlanilmagan edi. Shuning uchun ham Amerikalik olimlar K. Merril, M. Teyer va D. Petrichchianilarning bacterial virus yordamida og’ir irsiy kasallik – galaktozemiya bilan og’rigan odamning organizmidan tashqarida o’stirilgan teri hujayralariga irsiy material kiritilishi katta qiziqish uyg’otdi. Organizm hujayralarida galaktoza va uning mahsulotlari to’planishi natijasida galaktozemiya kasalligi paydo bo’ldi. Bu kasallikda galaktoza almashinuvini boshqaruvchi fermentning sintezlanishi buziladi. K. Merril, M. Teyer va D. Petrichchiani shu ferment sintezini kodlovchi bacterial virusni teri hujayralariga “o’tkazib”, irsiy nuqsonni bartaraf etdilar, bir necha kundan so’ng o’stirilayotgan hujayralarda yetishmayotgan fermentning sintezi qayd etildi va galaktoza to’planmay qoldi.

Genetik injeneriya bioximiya sohasida qilingan bir qancha kashfiyotlarga bog’liq holda rivojlandi. Irsiy informatsiyani nasldan-naslga berilishi gen nusxasi- informatsion RNK ning sintezlanishi bilan kechadi.
Teskari transkriptozaning kashf etilishi va ajratib olinishi genlarning kimyoviy sintezidagi mavjud qiyinchiliklani yengishda muhim ahamiyatga ega bo’ldi. Natijada RNK molekulasidagi ayrim qismlarning tuzilishini aniqlash va shu RNK nusxasi asosida DNKni sintez qilish kabi murakkab ishlarni bajarish kerak bo’lmay qoldi. Shu sabali bir vaqtning o’zida bir necha laboratoriyalarda shu ferment yordamida ayrim oqsillarni sintezlaydigan gen nusxasi tayyorlandi. Genetik injeneriya keyingi rivojlanishida DNK molekulasining aniq bir qismini kesuvchi va shu kesilgan qismlarni qayta biriktiruvchi fermentlarning aniqlanishi katta ahamiyatga ega bo’ldi. Shu metod yordamida hayvon genlari fragmentlariga bakterial viruslar DNK sini biriktirish imkoniyatiga ega bo’lindi.
Genetik injeneriya metodlari yordamida bakteriyalarga yuqori darajada tuzilgan organizmlarning genlarini kiritish va ularni shu yerda ko’paytirish mumkin bo’ladi. Hozirgi vaqtda bioximyoviy va molekulyar-biologik metodlarni qo’llanilishi natijasida yuqori darajada tuzilgan organizmlar genlarini ajratib olish va ularni kerakli miqdorda ko’paytirish mumkin yaqin kelajakda shu metodlar yordamida odamdagi ayrim irsiy kasalliklarni davolash mumkin bo’ladi. Hozir bemor organizmiga kasallikni to’g’irlay oladigan genni qanday kiritish yetarli hal bo’lmagan.
Yuqori darajada tuzilgan organizmlarda genetik transformasiya sohasida bir qancha ishlar qilindi. Masalan, fraksiyalanmagan DNK ni o’simlik, hasharot va ayrim hayvon hujayralariga yuborilganda, ulardagi irsiy belgilarning o’zgarishi aniqlandi.
Sog’lom organizm hujayralaridan ajratib olingan DNK ni irsiy o’zgarishlarga uchragan hujayraga yuborilganda undagi irsiy nuqsonlarni anchaginasini yo’qotish mumkin bo’ldi. Bu jarayonlarning molekulyar mexanizmi hali to’liq aniqlanmagan. Taxmin qilinishicha, begona DNK irsiy nuqsonli hujayra xromosomasiga joylanib, undagi mutatsiyalangan gen bilan joy almashinadi yoki sog’lom genning hujayra sitozplazmasida bo’lishi ham shu hujayradagi mutatsiyalangan gen ta’sirining yuzaga chiqishiga yo’l qo’ymaydi. Genetik injeneriya metodlari yordamida hozirgi kunda havodagi azotni o’zlashtira oladigan yangi bakteriyalarni yaratish ustida ish olib borilmoqda. Bunday bakteriyalar yordamida o’simliklar uchun zarur bo’lgan azotni o’g’itlar bilan tuproqni boyitish masalasi hal etiladi.
Genetik injeneriya tadqiqotlari hali laboratoriya doirasida olib borilmoqda. Ammo yaqin kelajakda “Genetik injeneriya” yutuqlari ko’pgina muhim amaliy masalalarning hal etilishiga olib keladi.
Gen muhandisligi qisqacha aytganda, genlar ustida turlar manipulyasiyalar o’tkazish, ularni to’la o’rganish asosida funksional qismlarga bo’lish, kerakli joyidan kesish, kerak bo’lmagan qismini olib tashlash, kerak bo’lgan qismlarini boshqa genlardan yoki sintez usuli bilan olib ulash va shu usulda tayyorlangan duragay yoki rekombinant geni organizmga kiritib (Masalan, odamning insulin genini mikrob hujayraga yoki sichqonning o’sish gormoni genini kalamushga) zarur turlarni yoki preparatlarni sintez qiliish va boshqa g’oyalar va texnologiyalarning yigindisidir. Ayrim DNK molekulalari-genlarning bir turini ko’p nusxasini hosil qilish maqsadida ilgaridan hujayralarning toza liniyalarini olishda ko’pdan beri ishlatilatib kelingan, klonlanish texnikasini molekulalarga moslashtirilgan variantda qo’llanilmoqda. Hujayra liniyalarining bir xilligini, klonlash usuli bilan kuchaytirish mumkin.
Klon­­­­­­­­ - deb birdan-bir old hujayradan kelib chiqgan hujayralar populyasiyasiga aytiladi. Klonlash asosan mutant hujayralar olish uchun ishlatiladi. Molekulyar klonlash DNK ning aniq bir namunasining toza holda ko’paytirishdan iborat.
1997 yil Yan Vilmut va uning hamkasblari qo’y klonini rekonstruksiya qildilar va Dolli ismli qo’y klonini yaratdilar. Dolli birinchi klonlangan sutemizuvchi edi. Vilmut va uning hamkasblari Shotland qoratumshuq qo’ylari tuxum hujayrasiga Dorsett qo’ylari sut bezlari hujayrasi yadrosini transplantatsiya qildi. Tuxum hujayra yadrosi kombinatsiyasi, birlashishi va hujayraning bo’linishini rag’batlantirish elektr energiyasi hisobiga amalga oshirildi (2-rasm).



2-rasm. Dolli birinchi klonlangan sutemizuvchi.

Transgen avlod berish imkoniyatiga ega bo’lgan 1 ta hayvon yaratish uchun 100 dan kam bo’lmagan hayvonlarni homilador qilishga to’g’ri keladi. Shuning uchun ham olimlar transgenozni samaraliroq usulini topishga harakat qildilar.

Shunday usullardan biri- embriondagi geni integratsiyasini retsipientga ko’chirib o’tkazguncha aniqlashdir. Embrionlarda kiritilgan DNK ni bor yo’qligini, rivojlanishni dastlabki bosqichda PCR yordamida aniklash mumkin deb taxmin qilingan edi. Ammo bu texnika, DNK ni nointegratsion shaklda uzoq muddatda saqlanganligi tufayli transgen embironlarni oddiy embrionlardan ajrata olmadi.
Воshqa bir usul, hamma miqdori genomga integratsiya qilingandagina ekspressiya qilinadigan reporter genlar faolligini aniqlashga asoslangan. Ulardan ba’zi birlari antibiotiklarga chidamlilikka (Bondioli K., 1996), lyusiferaza fermentini faolligini (Menck M.S. et.a1., 1998; NakamuraA. et.al, 1998) yoki yashil nur beradigan oqsilni (GFP) aniqlashga asoslangan. Bu oqsilni aniqlash juda ham oson, ammo uning espressiyasi faqat DNK integratsiyasi bilan chegaralanmaydi. Shuning uchun ham ijobiy yoki salbiy xatolikka yo’l qo’yilishi mumkin.
Transfikatsiya qilingan yadrolarni ko’chirib o’tkazish faqat transgen embrionlarni ko’chirish imkoniyatlarini ochadi, chunki bunda transgen integratsiyasi asosida tanlangan xujayralarning yadrosi ishlatiladi. TTTu > munosabat bilan rekonstruksiya qilingan embrionlarni transplantatsiya qilishdan keyin olingan har qanday yangi tug’ilgan organizm transgen bo’ladi va transgen embrionlarni keyingi seleksiyasi talab qilinmaydi.
Transfikatsiya qilingan yadrolarni ko’chirib o’tkazish, genomni maxsus qismiga to’g’ridan-to’g’ri integratsiya qilish imkoniyatini beruvchi ustunlikka ham ega. Mikroinyeksiya qilinganda transgenlar genomni har qanday qismida joylashib olishlari mumkin. Natijada ular ahamiyatli genlarni buzilishlari, yoki xromosomani translyasiya va transkripsiya uchun mumkin bo’lmagan qismlarida aralashib ketishlari va bundan tashqari ular hech qachon ta’sirchan bo’lmaydi.
Ikkinchi tomondan, mikroinyeksiya yordamida tuzilgan konstruksiyalar o’zi bilan qo’shimcha axborot olib kiradi va genomda bor axborotlarni boyitadi xolos. Agar biror bir endogen genlarni faolligini susaytirishdek muammolar maqsad qilib qo’yilsa, bunday muammolar to’g’ridan-to’g’ri emas, balki bilvosita yechiladi, masalan RNK yoki ribosomalar yordamida.