Kafedrasi “biotexnologiya” fanidan o‘quv-uslubiy majmua

5-mavzu: GEN INJENERLIGIDA QO’LLANILADIGAN FERMENTLAR

1. 
   Genlinjenerligi fermentlari
   
2. 
   Polimerazalar
   

Gen injenerligining fermentlari

Gen injencrligida rekombinant DNKlarni konstruksiyalashda ishlatiladigan fermentlar quyidagi guruhlarga bo'linadilar:

DNK fragmentini olish uchun ishlatiladigan fermentlar(restriktazalar);

• 
  DNK matritsasida DNKni (polimerazalar) va RNKni (qay-tar transkriptazalar) sintczlovchi fermentlar;
  
• 
  DNK fragmentlarini birlashtiruvchi fermentlar (ligazalar);
  

— DNK fragmenti uchlari strukturasini o'zgartiruvchi fermentlar.
(restriksiyalovchi endonukleazalar) — DNKmolekulasida ma'lum bir nukleotidlar ketma-ketligi (restriksiya sayt-lari)ni tanib, ularga «hujum qiluvchi» fermentlardir.
Restriksiya va modjfikatsiya tizimlari bakteriyalarda keng tar-qalgan bo'lib, ular rezident DNKni begona nukleolidlarning kiri-shidan himoya qiladi. 1968-yil Mezelson va Yuanlar metillanmagan DNKni parchalovchi restriktazani ajratib olganlar. 1970-yil esa Smit va Vilkoks Haemophilus influenzae dan DNKning aniq bir ketma-ketligini parchalovchi birinchi restriktaza (Hind III)ni ajratib olganlar. Hozirgacha 3500 dan ko'proq restriktazalarni substrat spetsifikligi aniqlangan bo'lib, ulardan 238 tasi nukletid ketma-ketligining unikal strukturasini taniydilar (prototiplar).
DNKning bir xil uchastkasini taniydigan restriktazalar izo-shizomerlar gumhini tashkil qilib, bir-bhiaridan ba'zi bir xossalari bilan farq qiladilar. Jumladan, 2 zanjirli DNKni har xil parcha-laydilar. Hozirgacha aniqlangan restriktazalarning yarmidan ko'prog'i, 4, 6, 8 nukleotid ketma-ketlikni taniydilar.
Bakteriyalarning barcha restriksion endonukieazalari o'ziga xos, qisqa DNK ketma-ketligini taniydi va ular bilan bog'lanadi. Bu jarayonda DNK molekulasi tanish saytida kesiladi. Bakteriya shtammi restriksion faollikka ega bo'lishi bilan birga DNKni metil-lash xususiyatiga ham ega bo'lishi mumkin.
Barcha restriktazalar DNKning qo'sh spiralida ma'lum bir ketma-ketlikni taniydi, lekin 1-sinf restriktazalari DNKmolckula-sining ixtiyoriy nuqtasini kesadi, 2- va 3-sinf restriktazalari esa tanish saytining ichidagi qat'iy bir nuqtalarni parchalaydi.
1- va 3-sinfdagi fermentlar murakkab subbirUkdagi tuzilishga ega bo'lib, 2-sinfdagi, ya'ni metillovchi va ATFga bog'liq endonuk-leazali faollikka cgadir.
2-sinf fermentlari 2 ta alohida oqsillardan: restriksiyalovchi endonukleaza va modifikatsiyalovchi metilazalardan tashkil topgan. Shuning uchun gen injeneriyasida asosan 2-sinf fermentlari ishla-tiladi. Bular uchun kofaktor sifatida magniy ionlari zarurdir.
Qaytar transkriptaza m-RNKni DNKning komplementar zanjiriga transkripsiyalash uchun ishlatiladi. Genomi bir zanjirli RNK molekulalaridan iborat bo'lgan retroviruslar o'rganilganda, retrovirusning hujayraning ichida sodir bo'ladigan rivojlanish jarayonida xo'jayin hujayra xromosomasiga ikki zanjirli DNK ko'rinishida o'z genomining integratsiya bosqichini bosib o'tishi aniqlangan. 1964-yil Temin RNK-matritsada komplementar DNKni sintezlovchi ferment borligini aniqlagan. Ushbu RNKga bog'liq DNK-polimeraza qaytar transkriptaza yoki revertaza debnomlangan.
Qaytar transkriptaza reaksiyasi RNK faollikka ega bo'lgan kuchli ingibitorlardan foydalangan holda maxsus sharoitlarda olib boriladi. Bunda RNK molekulalarining to'liq hajmli DNK-nus-xalari olinadi. Praymer sifatida poli (A)-tutuvchi m-RNK ning qaytar transkripsiyasida oligo (aT), З'-poli (A) uchiga ega bo'l-magan RNK molekulalari uchun esa kimyoviy sintczlangan oligo-nukleotidlar ishlatiladi. m-RNKda DN Kning komplementar zanjiri sintezlangandan va RNK buzilgandan keyingina DNKning ikki zanjiri sintezlanadi.
Matritsa sifatida k-DN Kning birinchi zanjiri bo'lishi mumkin. Bu reaksiya revertaza singari E. Coli ning DNK-polimerazasi yor-damida katalizlanishi mumkin. Sintez tugagandan so'ng k-DNK-ning 1- va 2-zanjirlari shpilka tuguni bilan kovalent bog'langan holda qoladi. Bu tugun endonukleaza Si bilan parchalanadi. Hosil bo'lgan ikki zanjirli DNKni klonlanayotgan vektorlarga kiritish, DNKning gibrid molekulalari tarkibida ko'paytirish va keyingi tadqiqotlarda ishlatish mumkinbo'ladi. 49-rasmda 2 zanjirU DNK-nusxasining sintez bo'lishi ko'rsatilgan.







49-rasm. RNK molekulasining ikki zanjirli DNK-nusxasini sintezlash chizmasi.