Hujayra va gen ingenerligi

DNK-ligaza genetik injeneriya metodlarida qo’llaniladi. DNK-ligaza eng muhim ferment bo’lib, DNK qo’sh zanjirida fosfodiefir bog’larni sintezini katalizlaydi. Genetik injeneriyada fag T₄ DNK-ligazasi qo’llaniladi, bu ferment ATF ishtirokida DNK yopishqoq va to’mtoq oxirlaridan tikadi. Bu ferment bitta polipeptid zanjiridan tashkil topgan ( molekulyar massasi 68 kDa) bo’lib, u DNK zanjiridagi fosfodiefir bog’larni, yani 5^I –fosfat bilan 3^I –fosfat orasidagi bog’larni sintezini tezlashtiradi.
DNK-polimeraza E.coli ni 1958-yili A.Kornberg va hammualliflar tomonidan ochilgan. Hozirgi vaqtda bu ferment DNK-polimeraza I deb atalib, bitta polipeptid zanjiridan tashkil topgan (103 kDa0. Har bird omen ma’lum fermentativ xususiyatni namoyon qiladi: oxirgi uchi N-bo’lgan domen 5^I →3^I –ekzonukleazali; oxirgi uchi C-bo’lgan domen 5^I →3^I –polimerazali (nukleotidiltransferazali); o’rtadagi domen 3^I →5^I -ekzonukleazali. Oxirgi uchi N-bo’lgan domen proteaz yordamida parchalanadi (tripsin, subtilizin va boshqalar bilan); molekulaning qolgan qismi (68 kDa)-Klenova fragmenti-katalitik aktivligini saqlaydi. DNK-polimeraza I ning 5^I→3^I –nukleazali aktivligi DNK bir zanjirining nukleotidlarini 5^I-oxirli uchidan parchalaydi, o’sha joyidan uziladi. Bunda bir vaqtda ikkita reaksiya boradi: 5^I→3^I ekzonukleazali gidroliz va 5^I→3^I polimerazali reaksiya. Bunday holat yani bir zanjirdagi uzilgan joyni DNK zanjiriga ko’chirish nik-translatsiya deb ataladi.
Agar yuqoridagi reaksiyada radioaktiv nukleotidlar qo’llanilsa, bunda nishonlangan DNK olish mumkin.
Nukleazalar bir zanjirli DNK ga nisbatan spesifikdir, u turli xil ob’ektlardan ajratib olingandir; mog’orli zamburug’lardan Aspergillus ovzae, Neurospora va boshqalar. Nukleaza SI, A.oryzaedan ajratib olingan bo’lib, u genetic injeneriyada (bir zanjirli uchastka) DNK ayrisini olib tashlab, qaytar transkriptazalar yordamida halqali DNK olishda ishlatiladi.
RNKaza H dupleksdagi RNK: DNK dagi RNK zanjirini parchalaydi. RNK aza H E.coli endoribonukleazalar bo’lib, ular oligoribonukleotidlarga ta’sir etadi. Ular genetic injeneriyada keng qo’llaniladi. Eukariot hujayralarida ham shunday endonukleazalar tipi mavjud.
Qaytar transkriptazalar (revertazalar). 1964-yili G.Temin shunday gipoteza ilgari surdi ya’ni spesifik RNK-saqlovchi retrovirus fermentlari macjud bo’lib, ular matritsali RNK orqali DNK ni sintezlash mumkinligi ko’rsatildi. 1970-yili G.Temin va S.Mizutani, shuningdek ularga bog’liq bo’lmagan holda D.Baltimor ham bu fermentni sarkoma Rausadan ajratib oldi. Bu ferment RNK-bog’liq DNK-polimeraza bo’lib, uni qaytar transkriptaza yoki revertaza deb nomlandi. Qushlar viruslarining revertazasi ko’proq o’rganilgan bo’lib, ikkita subbirlikdan tashkil topgan bo’lib-α (65kDa) va β (95 kDa); u uch xil aktivlikni namoyon etadi: DNK polimerazali ( RNK va DNK ni matritsa sifatida qo’llash mumkin); RNKaza-H aktivligini (RNK: DNK gibrid tarkibidagi RNK gidrolizlaydi, lekin erkin RNK ga ta’sir etmaydi); DNK-endonukleaza aktivligi. Birinchi va ikkinchi aktivligi DNK ni sintezida qo’llaniladi, komplementar virus RNK si xo’jayin-hujayra genomiga integratsiyalanadi. Endonukleaza aktivligi, xo’jayin-DNK zanjirini uzish uchun qo’llaniladi. Shu aniqlanganki, revertazaning β-subbirligi uchala aktivlikni namoyon qiladi, α-subbirlik-faqat DNK-polimeraza va RNKaza H aktivligini namoyon qiladi. Namuna sifatida ploimerazali reaksiyalarda bir zanjirli DNK va RNK molekulasining (shuningdek TRNK) kichik uchastkalari ishtirok etishi mumkin.
Genetik injeneriyada maqsadli sintez uchun DNKI ga (kDNK) molekulasiga komplementar bo’lgan matritsa RNK keng qo’llaniladi. Bu jarayonning effektivligini yanada oshirish uchun boshqa fermentlar ham qo’llaniladi.
Shunday olingan kDNK ga tez replikatsiyalanuvchi genetik elementlar (plazmidalar) qo’shilsa, bunday holatda kDNk klonlarini o’stirish mumkin. Turli mRNK qo’llab kDNK ni bibleotekasini olish mumkin. kDNK ning bibleotekasi genom DNK bibleotekasidan farq qiladi. DNK restriktaza bilan ishlanib olinadi. Terminal dezoksinukleotidiltransferaza buzoqning timusidan ajratib olingan bo’lib, bir zanjirli yoki ikki zanjirli DNK molekulasini 3^I-OH oxiridan nukleotidlarni o’stiradi. Uning yordamida DNK oxirini to’mtoq qilish mumkin ( agar 3^I-OH oxirli). Bu fermentni qo’llash bilan DNK fragmentiga oligonukleotidli ,,dumlarni’’ biriktirish mumkin. Agar boshqa DNK ni fragmenti unga komplementar boshqa dumni (oxirli) biriktirsa, unda gibridlanadi va gibridli (rekombinat) DNK molekulasi hosil bo’ladi. 1972-yili shu ferment yordamida birinchi gibridli DNK olingan.
DNK ning 3^I-oxiriga radioaktiv nukleotidlar yuborib aniqlangan.
Poli (A)-polimeraza E.coli 3^I –oxirli erkin uchiga bir zanjirli RNK poli (A) –ketma-ketligini biriktirishni katalizlaydi. Bu ferment poli A-dumni saqlamaydigan RNK molekulasini tayyorlashda ishlatilib, revertaza yordamida kDNK sintezlanadi.
Polinukleotidilkinaza E.coli dan ajratib olingan bo’lib, bu ferment bakteriofag (T₄) genomini kodlaydi va fosforli qoldiqlarni DNK va RNK molekulalarini 5^I –oxirli gidroksilli guruhlarga ko’chiradi, donor sifatida ATF ishtirok etadi, bunda radioaktiv ³²P qo’llaniladi.
Ikkinchi holatda restriktazaning ta’siri natijasida DNK da ,,yopishqoq oxiri’’ hosil bo’ladi. Restriksiyada yuqori spesifik ta’siri restriktazalarni II-sinfida kuzatildi,ya’ni genetic injeneriyaning eng muhim instrumentlaridan biri hisoblanadi. Bu restriktaza genomlarni xaritasini aniqlashda yordam beradi. 1976-yilda 84 ta restriktazalar aniqlangan bo’lsa, 1995-yilda 2400 ta shu sinf restriktazalari aniqlandi, 188 ta spesifik saytlarni restriksiya qiladi. Turli xil manbalardan ajratib olingan restriktazalar bir xil spesifikka ega bo’lib, ularni izoshimerazalar deb ataladi. Quyidagi jadvalda keng qo’llanilayotgan restriktazalar keltirilgan va ularni qaysi saytlar restriksiya qilishini ko’rsatib o’tilgan.
Oxirgi vaqtda II sinf restriktaza fermentlarida DNK ni palindrom bo’lmagan strukturalarni va ma’lum fiksatsiya qilingan uchastkalarida o’tmas va ,,yopishqoq oxiri’’ tanib birikib, parchalanishi aniqlandi. Ular II S sinfchasiga kirib (ingliz. Shift-qayta qurish, o’zgarish). DNK molekulasini har bir gidroliz qilingan joyi ya’ni ,,yopishqoq oxiri’’ unikal ketma-ketlikka ega. Bu shundan dalolat beradiki, restriktazalarni dastlabki tiklanayotgan DNK strukturasi fragmentlarini biriktirishga yo’naltirilgandir, masalan, fag fl ga nisbatan restriktaza Hpa 1 qo’llaniladi. Bu sinfchani yana bir fermenti Bbv 1 (Bacillus brevis)-DNK ketma-ketligini strukturasi taniydi.
GCAGC(N)₈
CGTCG(N)_12
va DNK ning bitta zanjirini 8 nuleotidni saytini tanib uzadi, boshqa zanjirida 12 ta nukleotiddan iborat uchastkani tanib uzadi.
III sinf restriktazalari I sinf fermentlari bilan o’xshashdir. Ularning aktivligi ATF, Mg²⁺ va S-adenozilmetionin ishtirokida ortadi. Bu restriktazalar ikkita subbirliklardan tashkil topgan (restriktazalar va metilazalar). Ular palindrom bo’lmagan ketma-ketlikni 5-6 juft nukleotidlarni taniydi va tanigan saytlardan 24-25 juft nukleotidlar masofasidan DNK parchalaydi.