Hujayra va gen ingenerligi

Kalsiy xloriddan (CaCl₂) foydalanib transformatsiyalash. Plazmida DNKsi bilan bakteriyaning transformatsiyalanishining ushbu usuli nisbatan ko’p qo’llaniladi [Mandel and Hida, 1970]. Bunda transformatsiyaga uchragan bakteriyalarning chiqishi E. coli HB101 shtammidan foydalanilib, pBP322 intakt DNKsining 1 mkg miqdoriga nisbatan 10⁵ – 10⁷ tani tashkil qiladi.
Kalsiy xlorid (CaCl₂) va rubidiy xloriddan (RbCl) foydalanib transformatsiyalash. Bu transformatsiyalash usuli [Kusher, 1978] nisbatan ko’proq E. coli SK1590 shtammi uchun mos keladi. Boshqa E. coli shtammlari transformatsiyalanishi uchun qo’llanilganda bu usulning samaradorigi qiymati oldingi tavsiflangan usulga nisbatan solishtirilganda yuqori hisoblanadi.
Plazmida va fag DNK si yordamidagi restriktsiyalash. Fermentning faolligi va miqdori. Har bir ferment preparati ma`lum bir faollik qiymatiga ega hisoblanadi. Restriktaza fermentining 1 birligi 1 mkg miqdordagi λ fag DNKsini to’liq gidrolizlash uchun yetarli hisoblanadi, odatda uning faolligi qiymati 10–20 birlik/mkl ga teng bo’lib, suyultirish talab qilinadi. DNK gidrolizlanishi fermentning 2–3 marotaba ko’p miqdorda olinishi sharoitida amalga oshadi, ya`ni 1 mkg DNK uchun 2–3 birlik ferment olinadi. Restriktaza fermenti –20^oC harorat sharoitida, 50%li glitserin tarkibida saqlanadi. Rekombinant DNK olish texnologiyasi bir butun tajriba jarayonlarini amalga oshirish kompleksini o’z ichiga oladi. Natijada tarkibiga spesifik genlar mavjud bo’lgan DNK zanjirining klonlanishi amalga oshiriladi. Albatta, bunda klonlash jarayonining samaradorligi DNK fragmentlarining kerakli o’lchamda va tegishli tartibdagi nukleotidlar ketma–ketligi sohasidan uzilishi bilan bog`liq hisoblanadi. DNK fragmentlarining aniq tartibda uzilishi restriksion endonukleaza II fermentlari ishtirokida amalga oshiriladi. Bu fermentlar DNK molekulasi tarkibida simmetrik tarzda fosfodiefir bog`lari bo’yicha uzilishini ta`minlaydi. Rekombnant DNK olish texnologiyasi umumiy tarzda–DNK zanjirining restriktaza orqali uzilishi, vektor yodamida tegishli DNK zanjiri fragmentining xo’jayin–hujayra genomi tarkibiga kiritilishi, uning ushbu sohada replikatsiyalanishi va transformatsiya jarayoni amalga oshishidan tashkil topgan. Rekombnant DNK olish texnologiyasida plazmidalardan vektor sifatida keng foydalaniladi. Rekombinant DNK olish texnologiyasi biotexnologiya sohasining jadal rivojlanishdagi yo’nalishlaridan biri hisoblanadi. Ushbu texnologiyaning asosiy maqsadi–in vitro sharoitida vektor yordamida begona gen elementlarining boshqa genom tarkibiga kiritilishidan iborat hisoblanadi. Rekombinant DNK olish texnologiyasida bevosita molekulyar genetika, molekulyar biologiya, nuklein kislotalar biokimyo yo’nalishlari tadqiqot usullaridan keng foydalaniladi.
Dastlabki rekombinant DNK olish texnologiyasi 1972 yilda P.Berg va uning hamkasblari tomonidan ishlab chiqilgan bo’lib, bunda maymun OV40 virusi va X dvgal bakteriofagi E. coli bakteriyasining galaktoza operoni bilan bog`langan. Shu sababli rekombinant DNK olish texnologiyasi yo’nalishining dunyoga kelishi shartli ravishda 1972-yil deb belgilangan.
Shuningdek, rekombinant DNK olish texnologiyasi rivojlanishida quyidagi kashfiyotlar muhim o’rin tutadi:
1869-yilda F.Misher tomonidan hujayralardan DNK molekulalarini ajratib olish usulining kashf qilinishi, 1953-yilda D.Uotson va F.Krik tomonidan DNK molekulasi struktura modelining kashf qilinishi, 1961-yilda A.Marmur va P.Doti tomonidan DNK molekulasining renaturatsiyasi va nuklein kislotalarning gibridizatsiyasi kashf qilinishi, 1962-yilda V.Arber tomonidan DNK restriktaza fermenti kashf qilinishi, 1968-yilda M.Mezelson va E.Yuan tomonidan birinchi marta restriktaza fermentining toza holatda ajratib olinishi, 1966-yilda M.Nirenberg, S.Ochoa, G.Koran tomonidan genetik kodning kashf qilinishi, 1967-yilda M.Gellert tomonidan DNK-ligaza fermenti aniqlanishi.
Ushbu tadqiqotlar natijalariga tayangan holatda 1972-1973 yillar davomida G.Boyer, S.Koen, P.Berg tomonidan rekombinant DNK olish texnologiyasi ishlab chiqilgan.
1975-1977-yillar davomida esa F.Senger, R.Barrel, A.Maksam, V.Gilbert tomonidan nukleotidlar ketma–ketligini aniqlash usullari ishlab chiqilishi, 1979-yilda G.Koran tomonidan RNK tirozin supressor genining kashf qilinishi ham rekombinant DNK olish texnologiyalarining takomillashishiga sezilarli ta`sir ko’rsatgan.
1981-1982-yillar davomida R.Palmiter, R.Brins-ter, A.Spredling, G.Rubin tomonidan drozofila pashshasi va sichqonlarning transgen zotlari yaratilgan. 1993-yilga kelib esa L.K.Ernst, G.Brem, I.V.Prokofevlar tomonidan ximozin genomi bilan transgen qo’y yaratilgan.
Rekombinant DNK texnologiyasi DNK zanjirining spesifik nukleazalar ta`sirida uzilishi va genom tarkibiga turli xil begona genlarning kiritilishi imkoniyatlari tug`ilishiga asoslanilgan bo’lib, bu texnologiya bevosita genetik manipulyatsiyalarni amalga oshishida samarali foydalaniladi.
Rekombinant DNK texnologiyasida vektor sifatida bakterial replikonlar (xromosomadan tashqarida joylashgan avtonom irsiylanuvchi genetik elementlar) plazmidalardan foydalaniladi.
Begona gen joylashtirilgan plazmidalar gibrid yoki ximer plazmidalar deb ataladi. Hozirgi kunda plazmidalar asosida rekombinant DNK olish texnologiyasi yo’nalishida ko’plab nazariy va amaliy yutuqlar qo’lga kiritilgan. Jumladan, ushbu usul yordamida bakteriya, achitqi va o’simlik hujayralari, hayvon hujayralari ustida yirik tadqiqotlar amalga oshirilgan. Ayniqsa, amaliy jihatdan iqtisodiy samaradorligi yuqori bo’lgan yo’nalish–bu gramm musbat bakteriyalar genomi tarkibini plazmidalar yordamida modifikatsiyalash muhim ahamiyatga ega hisoblanadi. Ushbu yo’nalishda Bacillus subtilis, streptomitsetlar va Sacchammyces cerevisiae genomi tarkibini kerakli yo’nalisha transformatsiyalar ishlari bajarilgan. Bunda masalan, V. subtilis–patogen bo’lmagan tuproq mikroorganizmlari asosida 40 dan ortiq fermentlar sintezlanadi va ularning genomini kerakli yo’nalishda modifikatsiyalar muhim amaliy ahamiyatga ega hisoblanadi. Streptomitsetlar esa bizga ma`lumki, biotexnologiyada asosan antibiotiklar produtsentlari sifatida ahamiyatga ega hisoblanadi.