Universum: химия и биология

Материалы и методы исследований. Материа-
лом исследований служили виды грибов рода 
Trichoderma, выделенные из почвы Ташкентской об-
ласти. С целью изучения возможности получения 
протопластов у исследуемых культур, грибы выра-
щивали глубинным способом на жидкой среде Ман-
дельса в течение 24-48 часов при 30
0
С. 
Выросший мицелий, осажденный центрифугиро-
ванием в стерильных условиях при 3000 об/мин в те-
чение 10 мин. Отмывали от среды сначала 2 раза ди-

---

№ 2 (68)
февраль, 2020 г.
18 
стиллированной водой, а затем дважды раствором ос-
мотического стабилизатора. Отмытый мицелий обра-
батывали литической смесью. 
При изучении влияния литических ферментов на 
выход протопластов, взятых в опыт культур, в каче-
стве литической смеси для получения протопластов 
использовали лиофилизированный препарат пищева-
рительного сока виноградной улитки Helix pomatia 
(ПСУ) в растворе осмотического стабилизатора (10 
мг/мл), лизоцим (10 мг/мл), ферментный препарат, 
полученный из культуральной жидкости Strepto-
myyces afghaniensis - 7 (10 мг/мл), обладающий актив-
ностью целлобиазы, протеазы, пектиназы и амилазы, 
смесь, состоящую из ПСУ (10 мг/мл) и лизоцима (5 
мг/мл), смесь ферментного препарата Streptomyyces 
afghaniensis - 7 (10 мг/мл) и лизоцима (5 мг/мл). 
Кроме вышеуказанных литических ферментов в ра-
боте использовали фермент из Trichoderma lignorum 
(целлолигнорин). В качестве соматического стабили-
затора во всех случаях использовали 0,7 М раствор 
NaCl. Литическую смесь стерилизовали через бакте-
риальный фильтр с диаметром пор 0,23 мкм и хра-
нили при 5
0
С. 
В опытах по изучению влияния осмотических 
стабилизаторов на частоту образования и процесс ре-
генерации протопластов у Trichoderma и Aspergillus 
в качестве стабилизаторов были использованы NaCl, 
KCl, MgSO
4,
сахароза, маннит. Все испытанные ста-
билизаторы были взяты в концентрации 0,4 и 0,7 М и 
0,2 М K-Na фосфатном буфере, рН 6,0-6,2. 
Мицелий грибом инкубировали в литической 
смеси при 30
0
С в течение 4-6 часов. Контроль за об-
разованием протопластов проводили методом свето-
вой микроскопии окрашивая клетки слабым водным 
раствором метиленового синего. Пробы отбирали 
каждые 30 мин. В течение всего времени инкубации. 
Через 4-6 часов от начала инкубации в литиче-
ской смеси образовавшиеся протопласты осаждали с 
помощью центрифугирования, при этом число обо-
ротов снижали до 1000 об/мин., так как протопласты 
чувствительны к повышенным нагрузкам. Затем про-
топласты дважды промывали в растворе осмотиче-
ского стабилизатора от литической смеси, отделяли 
от мицелий фильтрованием через стеклянный фильтр 
№3 и учитывали количество клеток в камере Горяева. 
Регенерацию протопластов осуществляли на 
среде Чапека с осмотическим стабилизатором по ме-
тоду, в основу которого был положен способ регене-
рации, предложенный Кожиной с соав.[5]. 
Проводя несколько последовательных разведе-
ний в осмотическом стабилизаторе, с помощью под-
счетов в камере Горяева определялось число прото-
пластов в исходной суспензии. В дальнейшем ис-
пользовалась суспензия с концентрацией 10
6 
прото-
пластов в 1 мл. 0,25 мл суспензии вливали в 50 мл 
теплой растопленной среды Чапека с осмотическим 
стабилизатором, эта смесь разливалась на поверх-
ность 5 чашек Петри с заранее разлитой средой того 
же состава. Эта среда должна обеспечить регенера-
цию клеточной стенки. Для контроля то же количе-
ство протопластов высевали непосредственно на по-
верхность среды Чапека, не содержащей осмотиче-
ского стабилизатора. Число регенерирующих прото-
пластов выражали в процентах от числа протопла-
стов в суспензии.