Gen regulyatsiyasi molekulyar mexanizmlari. Transformatsiya va transduksiya. Mundarija: Kirish

1.3. Takroriy boshqaruvlar va dnk transformatsiyasi.
Transformatsiya (lot. transformatio — qayta oʻzgarish, qayta hosil boʻlish) (genetikada) — hujayraga yot DNK kirishi natijasida uning irsiy xususiyatlari oʻzgarishi; prokariotlarda genetik material almashinish usullaridan biri. Birinchi marta ingliz olimi F. Griffit (1928) pnevmokokklarda kashf etgan. F. Griffit patogen pnevmokokklarni qizdirib oʻldirganda ular sichqonlarni zararlamasligini, lekin bakteriyalarni patogenlik xususiyatiga ega boʻlmagan tirik bakteriyalar bilan birga sichqonlarga yuborilganda nopatogen bakteriyalar patogenlik xususiyatiga ega boʻlishini aniqlagan. AQSH olimi O. Eyveri va uning xodimlari (1944) nopatogen bakteriyalar patogen boʻlib qolishi (transformatsiyalanishi)ning sababi patogen bakteriya shtammidan ajralgan DNK bilan bogʻliq ekanligini aniqladi. Transformatsiya . keyinchalik har xil turkum va turlarga mansub bakteriyalar — streptokokk, gemofill bakteriyalar, pichan tayoqchasi va boshqalarda aniqlangan. Transformatsiya . hodisasi kompetentlik xususiyatiga ega boʻlgan ayrim hujayralar bilan bogʻliq (hujayraning yot DNK ni bogʻlash xususiyati maxsus oqsil molekulasi sintezlanishi bilan tushuntiriladi). Transformatsiyalaydigan DNKning mol. massasi 300000 dan kam boʻlmasligi, 2 spiralli va kimyoviy toza boʻlishi lozim. Hujayraga donor DNK sining bir boʻlagi oʻtib, hujayra xromosomasi bilan rekombinatsiyalanadi va uning xossasini oʻzgartiradi.
Transformatsiya .dan bakteriyalarni genetik analiz qilishda va genetik injeneriya sohasidagi tajribalarda foydalaniladi. Transformatsiya . jarayonining kashf etilishi va oʻrganilishi natijasida DNKirsiyatning moddiy asosi ekanligi aniqlandi. Transformatsiyadan eukariot hujayralarga yot DNK ni kiritishda ham foydalaniladi 
Ishonchli natijalar to'g'ri nazorat qilingan tajribalardan takrorlanadi. Mustaqil o'zgaruvchiga bog'liq bo'lgan kuzatilgan fenotip vaqt o'tishi bilan va mustaqil o'zgaruvchini ifoda etuvchi tozalangan test plazmidining turli preparatlaridan mos bo'lishi kerak. Takroriy boshqaruvning ikki turi mavjud: texnik va biologik. Umuman olganda, texnik nusxalarni "plastinka boshqaruvlari" deb hisoblash mumkin. Ular mustaqil emas va odatda bitta manbadan olingan. Aksincha, biologik replikatlar mustaqil va ularni "takrorlanuvchanlikni boshqarish" deb hisoblash mumkin. Biologik replikatsiyalar - bu sizning namunangiz hajmini tashkil qiladi (aka sizning n qiymat) "va bir nechta mustaqil manbalardan olinishi kerak. Biz bularni quyida batafsilroq tasvirlab beramiz, lekin ma'lumot bo'limida keltirilgan maqolalar chuqurroq ma'lumot beradi. Texnik nazoratga misol sifatida bir xil alikvot/preparatdan tozalangan plazmidli bir nechta alohida quduqlarni (bir plastinka ichida) quyish mumkin. Replikatsiya nazorati mustaqil o'zgaruvchining ta'sirining takrorlanuvchanligini o'lchab yoki baholamaydi, chunki har bir quduqda ishlatilgan tozalangan plazmid, hujayralar va muhit mustaqil emas: ular bitta manbadan olingan va bitta plastinkada inkubatsiya qilingan. xuddi shu paytni o'zida. Replikatsiya nazorati muhim bo'lsa -da, bu mustaqil o'zgaruvchi bilan bog'liq bo'lgan kuzatilgan fenotipning takrorlanishi yoki izchilligi emas, balki tajriba o'tkazayotgan reaktivlar va qo'llarning izchilligi haqida gapiradi. Har qanday tajribalar to'plamida biologik nazorat ko'proq vaqt talab qiladi va oxir -oqibat muhimroqdir. Ideal holda, har bir biologik replikatsiya yangi vositalardan foydalanishi, hujayralar va plazmidlarning mustaqil bo'linmalarini sinovdan o'tkazishi, turli kunlarda bajarilishi va hokazo bo'lishi kerak, lekin tashqi cheklovlar ba'zi cheklovlar qo'yishi mumkin va siz o'z natijalaringizni sharhlashda buni bilishingiz kerak. Biologik nazoratning kaliti - bu mustaqillik: hech bo'lmaganda butun tajribangizni boshidan oxirigacha bir necha marta va turli kunlarda takrorlashingiz kerak. Yuqoridagi misolimizdan foydalanib, biz bir necha kun davomida hujayralarning turli alikvotlarida plazmid A ning turli xil preparatlarini sinovdan o'tkazardik. Biologiya mustaqil o'zgaruvchiga bog'liq bo'lgan kuzatiladigan fenotipning takrorlanishi va izchilligini nazorat qiladi va fenotipning yagona emasligini yoki faqat bitta alikvot/test plazmidini tayyorlash bilan bog'liqligini ta'minlashga yordam beradi.
Boshqa tomondan, RNKning transfeksiyasi yoki transduktsiyasi har doim vaqtinchalik. Transfeksiya yopishgan o'lmagan hujayralarda samarali bo'ladi, lekin asosiy va ildiz hujayralari transduktsiyani talab qiladi. Transfeksiya usulining chegaralanishi nozik hujayralar uchun transfeksiyaning toksikligi va uning boshqa genlar yoki oqsillar ekspresiyasiga shubhali ta'sirida yotadi. Lentiviral vektorlarni yaxshiroq bilish uchun ushbu ikkita texnikani va asoslarni taqqoslash haqida qo'shimcha ma'lumot olish uchun siz bizning Lentiviral vektorlarning asosiy sahifasiga tashrif buyurishingiz mumkin. Mikroenjeksiyon, gen quroli, elektroporatsiya va gidrodinamik etkazib berish - bu genomni tahrirlash vositalarini hujayralarga etkazish uchun ishlatilgan usullar [35-38]. Bu usullar keng qo'llanilmaydi, chunki ularga maxsus uskunalar va tajribali mutaxassislar kerak (mikroinjeksiyon) yoki ular hujayra yoki to'qimalarning shikastlanishi (gen quroli, elektroporatsiya va gidrodinamik etkazib berish) bilan bog'liq. Bu usullar, shuningdek, in vivo jonli xost to'qimalariga etib borishi bilan cheklangan. Genlarni etkazib berish uchun katyonik lipidlar, polimerlar va dendrimerlar kabi kimyoviy vositalar keng qo'llanilgan, lekin ular genlarni etkazib berish samaradorligi bilan bog'liq bo'lib, ular odatda virusli vektorlarga qaraganda past bo'ladi. Ammo, virusli usullar bilan taqqoslaganda, kimyoviy etkazib berish usullari, ba'zi hollarda, ularning tayyorlash qulayligi, past immunogenligi va kam xarajati tufayli afzal ko'riladi.
Kimyoviy genlarni etkazib berishning barcha usullari genomni tahrirlashda qo'llanilishi mumkin, chunki maqsadli nukleazalarni kodlovchi plazmidlar va boshqa genlarni kodlovchi plazmidlar o'rtasida kimyoviy farq yo'q. Biroq, oqsillarni etkazib berish uchun turli mexanizmlar jalb qilinishi mumkin. Katyonik lipozomalar shu maqsadda muvaffaqiyatli ishlatilgan. Cas9 -gRNA komplekslari yoki TALENlarni katyonik lipidlar orqali etkazib berilishi bozorda sotiladigan ko'plab sotuvchilar tomonidan aniq ko'rsatiladi. Katyonik polimer poli (etilenimin) o'z-o'zidan yig'ilgan DNK qafaslarini Cas9/gRNK komplekslarini sutemizuvchilar hujayralariga muvaffaqiyatli etkazib berish uchun ishlatilgan [42]. Hujayra ichiga kiruvchi peptidlar nukleaza oqsillarini, shu jumladan Cas9 va TALENni etkazib berish uchun ishlatilgan. Qizig'i shundaki, ZFN o'ziga xos hujayralarga kirish qobiliyatiga ega va tashuvchisiz hujayralarga o'tishi mumkin.
Viruslar o'nlab yillar davomida genlarni etkazib berish uchun ishlatilgan [46]. Genlarni tahrir qilish uchun bir nechta viruslar, jumladan lentivirus [47], adenovirus [48] va adeno bilan bog'liq virus (AAV) [49] baholandi. Lentiviral vektorlarning bir nechta asosiy hujayra turlarida transduktsiya samaradorligi yuqori ekanligi va mezbon genomiga birlashtirilgan genlarga ega bo'lishlari isbotlangan [39,50]. Yuqorida aytib o'tilganidek, genomga nukleazani kodlovchi genni kiritish fermentning konstitutsiyaviy ifodasini keltirib chiqarishi mumkin, bu esa maqsadsiz hodisalarga olib kelishi mumkin. Bundan ham yomoni, lentiviral integratsiya tasodifan sodir bo'ladi, bu esa potentsial ravishda turli xil malignitlarni keltirib chiqarishi mumkin [51,52]. Bu integratsiyalashuv muammolarining echimlaridan biri bu ZFN, TALEN va Cas9 kodlovchi genlarni uzatish uchun ishlatilgan, integrazani kodlovchi virusli genni nokaut qilishdir [20,53]. Yana bir yechim-nukleaza oqsillarini tashish uchun lentivirusdan olingan zarrachalarni ishlab chiqish. ZFN, TALEN va Cas9 oqsillari bunday lentiviral zarralarga muvaffaqiyatli qadoqlangan [47,54]. Donor shablonlari DNKni maqsadli kiritish va genlarni tuzatishga erishish uchun zarrachalarga ko'chirildi [54]. Ma'lum bo'lishicha, bu yondashuv an'anaviy etkazib berish usullariga qaraganda maqsadli faollikdan pastroqdir [47,54].
Adenoviral vektorlar bo'linadigan va bo'linmaydigan hujayralarda vaqtinchalik transgenli ekspressiya qilish imkonini beradi. Bu vektorlar retrovirusli hamkasblariga qaraganda genomik integratsiya xavfini ancha past. "Yordamchiga bog'liq adenoviral vektorlar" deb nomlangan uchinchi avlod adenovirusli vektorlar to'plami yuk hajmini oshirdi (k8 kbit / s dan farqli o'laroq 36 kb) [55], bu genlarni kiritish uchun donor DNK andozalarini etkazib berish uchun ko'p qirrali bo'lishini ta'minlaydi. tuzatish. Ammo, virusning barcha usullari uchun bo'lgani kabi, immunogenlik hamon tashvishlantiradi [56], ayniqsa, bir nechta genlarni etkazib berish hodisalari o'tkazilishi kerak.
Adenovirus singari, AAV ham bo'linadigan, ham bo'linmaydigan hujayralarda vaqtinchalik transgen ifodasini ishlab chiqarishi mumkin. Genlarni etkazib berishda ma'lum AAV serotiplariga ustunlik beriladi, chunki ularning etkazib beriladigan genlari mezbon genomga maqsadli tarzda qo'shiladi. Konstitutsiyaviy ifodalangan nukleazalar bilan bog'liq muammolar haqida oldingi munozarani yodda tutgan holda, virusli bo'lmagan rekombinant AAV ishlab chiqarildi. vakil genomik integratsiya chastotasini kamaytirish yoki yo'q qilish uchun gen [57]. AAVning ba'zi shtammlari bir martalik immunogenlik xavfini kamaytiradi, lekin takroriy qabul qilish ikkilamchi immun javobdan qochish uchun har xil serotiplarni talab qiladi. Bu viruslar nisbatan kichik, shuning uchun ular DNK yuklanish imkoniyatlari cheklangan (5 kb) [58]. Ikkita monomerli ZFNlar [59] odatda bu cheklovga mos keladi, lekin bitta AAV vektoriga [60] ikkita TALEN monomerini (har biri 3 kb) yoki SpCas9 (p4,2 kb) va tegishli gRNKni yig'ish qiyin. In vitro genomni tahrir qilish uchun funktsional birliklarni alohida qadoqlash va hujayralarni kotransduktsiya qilish orqali bu cheklovni engib o'tish mumkin. Keyin tahrirlangan katakchalarni ekranlash va tanlash mumkin. Biroq, bu in vivo tahrir qilish uchun amaliy emas, chunki tanlov bosqichini bajarish mumkin emas va har bir g'ayritabiiy hujayrani davolash kutilmoqda. Fermentni kodlaydigan genning hajmini kamaytirish mumkin: Cas9 ortologi S. aureus Cas9 (SaCas9) aniqlandi, bu SpCas9dan 1 kb kichikroq [60]. Kichik gen bitta AAV konstruktsiyasida gRNK bilan muvaffaqiyatli nusxalangan, aniq genom tahririga hali ham erishish mumkin.