Флавоноиды, принадлежащие к классу полифенольных соединений растительного происхождения, относятся к вторичным продуктам метаболизма растений

Методы выделения флавоноидов и их идентификация

Для выделения флавоноидов проводят экстракцию растительного материала этанолом или метанолом, учитывая растворимость агликонов и гликозидов флавоноидов в спирте. Спиртовое извлечение упаривают, к остатку добавляют горячую воду и после охлаждения удаляют неполярные соединения (хлорофилл, жирные и эфирные масла.), т.к. при охлаждении они выпадают в осадок, который отделяют.

Часто для отделения сопутствующих веществ сырье сначала обрабатывают хлороформом, т.е. «обезжиривают», а затем уже экстрагируют спиртом разной концентрации. Спиртовое извлечение исследуют. Проводят качественный и количественный анализ.
Флавоноиды из водной фазы извлекают последовательно этиловым эфиром (агликоны), этилацетатом (в основном монозиды) и бутанолом (биозиды, триозиды). Для разделения компонентов каждой фракции используют колоночную хроматографию на силикагеле, полиамидном сорбенте или целлюлозе.
Элюирование веществ проводят смесью хлороформа с метиловым спиртом с возрастающей концентрацией метилового спирта, спирто-водными смесями с возрастающей концентрацией спирта, если сорбентом служит полиамид, или 5-30 %-ной уксусной кислотой в случае целлюлозы.
Для идентификации флавоноидов используют их физико-химические свойства:
‒ определение температуры плавления
‒ определение удельного вращения гликозидов
‒ сравнение УФ, ИК, масс-, ПМР спектров со спектрами известных образцов.
УФ спектр флавоноидов характеризуется наличием, как правило, двух максимумов поглощения. УФ спектроскопия успешно используется для установления свободных ОН-групп в молекуле флавоноида путем добавления различных реактивов (ацетата натрия, метилата натрия, борной кислоты с ацетатом натрия, хлористого алюминия).
При добавлении этих реактивов происходит смещение максимумов поглощения, характерное для гидроксильных групп в различных положениях. В ИК спектре флавоноидов имеются полосы поглощения, характерные для различных
группировок [2].
Выделение флавоноидов из ЛРС. Наиболее удобным способом получения биологически активных соединений, в том числе и флавоноидов, из лекарственного растительного сырья является экстракция. Экстракция суммы флавоноидов из ЛРС проводится 70%, 80% этанолом или метанолом. При экстракции отдельных групп флавоноидов используют различные составы органических растворителей: этиловый эфир, этилацетат, н-бутанол, смесь хлороформа с этанолом, спирто-водные смеси и др.
В процессе экстракции лекарственного растительного сырья следует учитывать, что данный технологический процесс подвержен воздействию большого количества разнообразных факторов, которые связаны различными
закономерностями [17].
Ключевыми параметрами экстракции флавоноидов являются: температура, время экстракции, концентрация этанола, соотношение сырье ‒ экстрагент [18].
Контроль за ходом разделения флавоноидов проводят методом хроматографии: используют ТСХ, БХ или высокоэффективную газожидкостную хроматографию. Наиболее подходящими системами для БХ флавоноидов являются: 15%, 60% растворы уксусной кислоты; бутанол – уксусная кислота ‒ вода (4:1:5). Для ТСХ: хлороформ ‒ метанол (8:2).
Установление структуры выделенных соединений проводят с помощью физико-химических методов:
‒ определение температуры плавления;
‒ определение удельного вращения (гликозидов);
‒ сравнение УФ-, ИК-, масс-, ПМР-спектров со спектрами известных
образцов [19].
Для качественного определения флавоноидов часто используют следующие реакции:
1. Характерная реакция на флавоноиды ‒ цианидиновая проба или проба Синода (основана на восстановление их атомарным водородом в кислой среде в присутствии магния или цинка). Флавоноиды при восстановлении магнием или цинком в присутствии концентрированной хлористоводородной кислоты образуют красное окрашивание, обусловливаемое образованием антоцианидинов:

хроменол

цианидин хлорид
Реакция очень чувствительна, основана на восстановлении карбонильной группы и образовании антоцианида. Халконы и ауроны при помощи цианидиновой реакции не обнаруживаются, но при добавлении конц. HCl (без магния) образуют красное окрашивание за счет образования оксониевых солей.
2. Борно-лимонная реакция. 5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы взаимодействуют с борной кислотой в присутствии лимонной (или щавелевой), образуя ярко-желтое окрашивание с желто-зеленой флуоресценцией (образование батохромного комплекса):

3. Реакция с треххлористой сурьмой. 5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы, взаимодействуя с треххлористой сурьмой, образуют комплексные соединения, окрашенные в желтый или красный цвет:

4. С раствором аммиака, щелочи:
‒ флавоны, флаваноны, флавонолы, флаванонолы дают желтое окрашивание, при нагревании переходящее в оранжевое или красное;
‒ халконы и ауроны тотчас же дают красное или пурпурное окрашивание.
Чистые катехины окрашивания не дают, однако присутствие даже в небольшом количестве примесей (продуктов окисления) вызывает появление желтой окраски.
Антоцианы в присутствии аммиака или карбоната натрия дают синее или фиолетовое окрашивание.
5. С 1 %-м раствором ванилина в концентрированной HCl образуют красно-малиновое окрашивание катехины (производные флороглюцина и резорцина).
6. Флавоны, халконы, ауроны, содержащие свободные орто-гидроксильные группировки в кольце В, при обработке спиртовых растворов средним уксуснокислым свинцом образуют осадки, окрашенные в ярко-желтый и красный цвета. Антоцианы образуют осадки, окрашенные как в красный, так и в синий цвета.
7. С 1-2 %-ным спиртовым раствором AlCl₃ желто-зеленое окрашивание говорит о наличии флавоноидов.
Хроматографические методы анализа. С целью обнаружения флавоноидов в растительном материале широко используется хроматография на бумаге и в тонком слое сорбента. Обнаружение компонентов на хроматограмме осуществляется просматриванием их в УФ свете. При этом флавоны, флавонол-3-гликозиды, флаваноны, халконы и их 7-гликозиды проявляются в виде желтых или желто-зеленых пятен; флавонолы и их 7-гликозиды – в виде желтых или желто-зеленых пятен; ксантоны в виде оранжевых пятен. Изофлавоны при этом не проявляются.
После просматривания в УФ свете хроматограммы можно обработать одним из реактивов:
1) 5 %-ным спиртовым раствором AlCl₃ c последующим нагреванием при 105 °С в течение 3-5 минут; (ярко-желтая окраска пятна в видимом свете и яркую желто-зеленую флуоресценцию в УФ свете);
2) с 5 %-ной SbCl₃ в четыреххлористом углероде (реактив Мартини-Беттоло); Желтая или желто-оранжевая окраска указывает на наличие флавонов, флавонолов, флаванонов и изофлавонов; красная или красно-фиолетовая – халконов;
3) с 2 %-ным спиртовым раствором щелочи;
4) при обработке пятна парами аммиака усиливается голубая флуоресценция (изофлавоноиды), что позволяет получить зоны с более яркой флуоресценцией в УФ свете. Реактив Вильсона (раствор борной и безводной лимонной кислоты в безводном метаноле).
5) Реакция азосочетания – на наличие 7-оксифлаванолов, 7-оксиизофлаванолов.


Количественное определение. В последние годы все большее распространение получают различные физико-химические методы анализа, которые имеют ряд существенных преимуществ в сравнении, например, с гравиметрическими и титриметрическими методами, а именно, быстрота и точность определения, обнаружение даже незначительных количеств и, что особенно важно, возможность выделения отдельных флавоноидов из растительного сырья.
К таким методам относятся фотоэлектроколориметрия, спектрофотометрия, денситометрия с использованием хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента.
Сущность хроматоденситометрического метода заключается в выделении и разделении флавоноидов с непосредственной количественной денситометрической оценкой окрашенной зоны на хроматограмме. Метод имеет преимущества в быстроте проведения анализа и точности определения, так как в данном случае исключается стадия элюирования.
Используется фотоколориметрический метод, основанный на измерении оптической плотности окрашенных растворов, полученных в цветных реакциях флавоноидов с солями различных металлов (алюминия, циркония, титана, хрома, сурьмы), с лимонно-борным реактивом и на реакции восстановления цинком или магнием в кислой среде.
Известна цветная реакция флавоноидов с азотнокислым и уксуснокислым уранилом, позволяющая количественно определять рутин в смеси с кверцитином.
В настоящее время широко используется метод спектрофотометрический [20].
Для количественного определения флавоноидов в растительном сырье наибольшее распространение получили физико-химические методы, прежде всего фотоколориметрия и спектрофотометрия.
Фотоколориметрический метод основан на цветных реакциях комплексообразования с солями различных металлов (алюминия, циркония, хрома, сурьмы); на реакции с лимонно-борным реактивом и на реакции восстановления атомарным водородом в кислой среде в присутствии металлического магния или цинка.
Спектрофотометрический метод основан на способности флавоноидов поглощать свет в УФ-области спектра.
Хромато-спектрофотометрический метод – более совершенный метод количественного определения флавоноидов, используется в сочетании с хроматографией, что позволяет произвести очистку и разделение суммы веществ на отдельные компоненты.
Реже используют флюориметрический и полярографический методы.
Наличие фенольных гидроксилов, обуславливающих слабокислые свойства флавоноидов, позволяет использовать метод кислотно-основного титрования в неводных растворителях: диметилформамиде, диметилсульфоксиде, ацетоне [21].
Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) является быстрым, хорошо воспроизводимым методом, который требует малого количества анализируемого вещества и используется для количественного, качественного анализа и препаративного выделения [22].
Для флавоноидов более употребительны колонки с обращенно-фазными сорбентами (RP-8; RP-18) и детектирование с помощью УФ-видимого детектора с переменной длиной волны. В настоящее время широко используется фотодиодный детектор, позволяющий одновременно с выделением пика на хроматограмме получать УФ-видимый спектр вещества, соответствующего этому пику. Такой экспериментальный прием значительно облегчает задачу идентификации веществ.
Подвижные фазы (элюентные системы), как правило, бывают бинарными и содержат подкисленный полярный компонент (водные растворы уксусной, перхлорной, фосфорной или муравьиной кислот) и менее полярный органический растворитель (метанол или ацетонитрил). Подвижная фаза может поступать в колонку как в изократическом, так и в градиентном режиме, когда в ходе процесса хроматографирования происходит во времени изменение соотношения компонентов подвижной
фазы [22, 23].
Градиентный режим наиболее подходит для разделения сложных смесей флавоноидов. Для колонок с обращенно-фазными сорбентами типичные градиентные программы основаны на использовании подвижных фаз с преобладанием на старте доли полярного растворителя с дальнейшим постепенным возрастанием доли менее полярного растворителя.
Соотнесение пика на хроматограмме с «принадлежащим» ему веществом является наиболее трудной задачей. Удобным приемом является использование параллельного хроматографирования хорошо известных, так называемых стандартных образцов и сравнение с ними хроматограммы исследуемого объекта. Стандартное вещество в идеале должно быть наиболее родственно флавоноидам и иметь подобные хроматографические свойства. В тех случаях, когда стандартное вещество хроматографируется в равных условиях, но параллельно, его называют внешним стандартом. Внутренний стандарт (добавляется в исследуемую пробу перед вводом в хроматограф) должен отвечать следующим условиям: в исследуемой смеси не должно содержаться аналогичное вещество и пик стандарта не должен перекрываться с каким-либо соединением в смеси. Такие ограничения отсутствуют в случае применения внешнего стандарта.
Преимуществами внутреннего стандарта является подтверждение достоверности экстракции, подготовки образца, хроматографической процедуры. В качестве стандартного вещества для флавоноидов часто используется рутин, являющийся коммерческим доступным продуктом. Он хорошо подходит для количественного анализа флавоноловых гликозидов. Для содержащихся в смеси других флавоноидов могут быть использованы такие коммерчески доступные стандарты, как апигенин-7-глюкозид – для флавоновых гликозидов, катехин – для флаван-3-олов, нарингенин – для дигидрофлавонов, дигидрокверцетин – для дигидрофлавонолов, даидзеин – для изофлавонов [22, 23].
Для количественного анализа строится кривая зависимости концентрации флавоноида от площади пика для каждого стандарта в тех же самых хроматографических условиях (длина волны, растворитель), которые применяются по отношению к исследуемой смеси. Соответствующие калибровочные кривые могут быть использованы для расчета количества флавоноида, представляемого каждым пиком ВЭЖХ хроматограммы. В настоящее время практически исчезла надобность в построении калибровочных кривых в связи с обеспечением хроматографов компьютерной системой обсчета площадей пиков [22, 23].

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. 
   Яковлева, Г.П. Лекарственное сырье животного и растительного происхождения. Фармакогнозия / Г.П. Яковлева. – Спб.: Спецлит, 2006. – 845с.
   
2. 
   Лекарственные растения и лекарственное растительное сырье, содержащие флавоноиды [Электронный ресурс] / Авторская платформа Pandia.ru. – Режим доступа: http://www.pandia.ru/text/77/455/13448.php. – Дата доступа: 02.02.2016.
   
3. 
   Муравьева, Д.А. Фармакогнозия / Д.А. Муравьева, И.А. Самылина, Г.П. Яковлев. – Москва: Медицина, 2002 – 656с.
   
4. 
   Флавоноиды, общая характеристика [Электронный ресурс] / Зеленая аптека. – Режим доступа: http://www.fito.nnov.ru/special/glycozides/flavo/. – Дата доступа: 02.02.2016.
   
5. 
   Гришина, Е.И. Фармакогнозия: учебное пособие / Е.И. Гришина, И.С. Погодин, Е.А. Лукша. – Омск: ОмГМА, 2002. – 1067 с.
   
6. 
   Биофлавоноиды [Электронный ресурс] / Диэнай Екатеринбург. – Режим доступа: http://dnaekb.ru/statmain/statmain/93-lib-bioflav.html. – Дата доступа: 02.02.2016.
   
7. 
   Pietta P.G. Flavonoids as antioxidants / P.G. Pietta // J. Nat Prod. – 2000. –Vol.63. – P.1035–1042.
   
8. 
   Benthsath, А. Vitamin nature of flavones / А. Benthsath, S. Rusznyak, A. Szent-Gyorgy // Nature. – 1936. – P. 798.
   
9. 
   Benthsath, А. Vitamin P / А. Benthsath, S. Rusznyak, A. Szent-Gyorgy // Nature. – 1937. – P. 326.
   
10. 
    Beiler J.M. Inhibitory action of vitamin P compounds on hyaluronidase / J.M. Beiler, G.J. Martin // J. Biol Chem. – 1947. – Vol.171. – P.507–511.
    
11. 
    Stimulation of neuroregeneration by flavonoid glycosides [Electronic resource]. – Mode of access: www.google.com/patents/US20120087980. – Date of access: 21.02.2016.
    
12. 
    Kaempferol attenuates 4-hydroxynonenal-induced apoptosis in PC12 cells by directly inhibiting NADPH oxidase / Y. Jang [et al.] // J. Pharmacol Exp Ther. – 2011.
    
13. 
    Лекарственные растения [Электронный ресурс] / Энциклопедия лекарственных растений. – Режим доступа: http://lek-rast.ru/rastenija-226.htm. – Дата доступа: 06.03.2016.
    
14. 
    Тихонов, В.Н. Лекарственные растения, сырье и фитопрепараты: учебное пособие / В.Н. Тихонов, Г.И. Калинкина, Е.Н. Сальникова. – Томск: СибГМУ, 2004. – 264.
    
15. 
    Рабинович, М.И. Лекарственные растения в ветеринарной практике: справочник / М.И. Рабинович. – Москва: Агропромиздат, 1987. – 288 с.
    
16. 
    Каталог лекарственных трав/растений [Электронный ресурс] / Портал грибников Беларуси Боровик.by. Режим доступа: http://www.borovik.by/herbs/travniku/katalog-lekarstvennyix-trav/rastenij/. – Дата доступа: 02.02.2016.
    
17. 
    Федосеева, Л.М. Расчет эффективности процесса экстракции бурых листьев бадана толстолистного / Л.М. Федосеева // Химия растительного сырья. –
    2000. – № 1. – С. 117–119.
    
18. 
    Мягчилов А.В. Выделение флавоноидов из шелухи гречихи посевной – Fagopyrum sagittatum gilib / А.В. Мягчилов, Л.И. Соколова // Химия растительного сырья. – 2011. – №2. – С. 123–126.
    
19. 
    Васильев Р.Ф. Хемилгомипесценция, активированная производными антрацена / Р.Ф. Васильев, А.А. Вичутинский, А.С. Черкасов // Доклады АН СССР. – 1963. – Т. 149, № 1. – С. 124–127.
    
20. 
    Коннова, С.А., Каневский М.В., Алиева З.О., Шувалова Е.П. Методы выделения и анализа флавоноидов высших растений и исследования их активности в отношении ризобактерий: учебно-методическое пособие для студентов биологического факультета / С.А. Коннова, М.В. Каневский, З.О. Алиева, Е.П. Шувалова. – Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2015. – 31 с.
    
21. 
    Коноплева М.М. Фармакогнозия: природные биологически активные вещества: учебное пособие / М.М. Коноплева. – Витебск: ВГМУ, 2007. – 235 с.
    
22. 
    Органическая химия: учебник для вузов: в 2 кн. Кн.2: Специальный курс/ Н.А. Тюкавкина, С.Э. Зурабян, В.Л. Белобородов и др.; под ред. Н.А. Тюкавкиной. – М.: Дрофа, 2008. – 592с.
    
23. 
    Сычев, С.Н. Высокоэффективная жидкостная хроматография на микроколоночных хроматографах серии «Милихром»: Монография / С.Н. Сычев, К.С. Сычев, В.А. Гаврилина. – Орел: ОрелГТУ, 2002. – 134с.