Экспериментальные

Молекулярный метод гибридизации in situ (ме- тод FISH – fluorescent in situ hybridization) исполь- зовали для оценки биомассы метаболически ак- тивных клеток бактерий [17–19]. В работе приме- нен спектр зондов, специфичных для представителей домена Bacteria, а также отдель- ного филума Actinobacteria [18]. Использовали рРНК-специфичные флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды с последовательно- стью нуклеотидов для группы Bacteria: 5'-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3' для группы Actino- bacteria: 5'-TAT AGT TAC CAC CGC CGT-3' в со-
четании с немеченым олигонуклеотидом 5-TAT AGT TAC GGC CGC CCGT-3. Количество мета- болически активных микробных клеток, содер- жащихся в 1 г почвы, вычисляли по формуле (1).
Препараты анализировали с использованием люминесцентного микроскопа ZEIZZ Axioskop 2 plus (Германия) со светофильтрами Filterset 15 для зондов и Filterset 09 для окраски акридиновым оранжевым. Численность целевых групп микро- организмов в образцах определяли путем учета количества гибридизированных с зондами клеток в 50 полях зрения микроскопа на одной ячейке, с последующим расчетом численности соответ- ствующих популяций на 1 г почвы.
Анализ ПЦР. С образцами пустынной такыро- видной почвы был проведен анализ продуктов амплифицированного 16S гена суммарной ДНК, выделенной из почвы, и ДНК чистых культур на основе денатурирующего градиентного гель- электрофореза (DGGE-метод) [20, 21]. Для выде- ления ДНК из чистых культур микроорганизмов применяли WizardGenomic DNA PurificationKit (“Promega”, США). Суммарную ДНК из почв экс- трагировали с помощью PowerSoil DNA IsolationKit (“MO BIO”, США), руководствуясь инструкциями

производителя. Фрагмент гена 16S rRNA (626 п.н.) амплифицировали с использованием универ- сальных праймеров 341F+GC и 907R [22].

341F 5'-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCCCCG CCC CCT CCT ACG GGAGGC AGC AG-3'

907R 5'-CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT-3'

M = C : A, R = G : A, везде 1 : 1.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) прово- дили в 50 мкл реакционной смеси следующего со- става: смесь Master-Mix (2X, “Fermentas”), по
12.5 пмоль прямого и обратного праймеров, около 25 нг ДНК-матрицы. Для проведения ПЦР ис- пользовали температурно-временной профиль для соответствующей группы праймеров: первый цикл: 94°С – 5 мин; последующие 15 циклов: 94°С– 1 мин, 55°С – 1 мин и 72°С – 3 мин. После окончания последнего цикла смеси дополнитель- но выдерживали 7 мин при 72°С для достройки не- завершенных цепей.
Полученные ПЦР-фрагменты разделяли с по- мощью денатурирующего градиентного гель- электрофореза (ДГГЭ) на оборудовании DCode Universal Mutation Detection System (“BioRad”, США) в Институте микробиологии РАН согласно протоколу [23]. ПЦР-фрагменты разделяли в 6% полиакриламидном геле (отношение содержания акриламида к бисакриламиду 37.5 : 1) в денатури- рующем градиенте 40–65% (100% денатурант со- держал 7 М мочевину и 40% формамида). Форез проводили в однократном TAE-буфере (40 M трис-ацетат, 1 мM ЭДTA, pH 7.4) при температуре 60°С и напряжении 100 В в течение 16 ч. Окраши- вание геля осуществляли с помощью бромистого этидия (0.5 мкг/мл) в течение 30 мин, затем гель отмывали от остатков красителя в течение 30 мин. Результаты документировали с помощью имидж- системы GelDoc (“BioRad”, США). Основные ви- димые полосы были вырезаны, и ДНК была элюи- рована стерильной деионизованной водой. Затем продукт был реамплифицирован и использован для определения нуклеотидных последовательно- стей в сервисной лаборатории. Секвенирование генов 16S рРНК проводили в Центре “Биоижене- рия” РАН с использованием автоматического ка- пиллярного секвенатора (SilverSequence d/ddNTP- Mixes, “Promega”, США).
Последующий анализ нуклеотидных последо- вательностей был проведен с помощью про- граммного пакета BLAST. (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/blast). Редактирование последовательно- стей осуществляли с помощью редактора BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html), а их множественное выравнивание – с использо- ванием программы CLUSTAL W 1.75. Построение
дендрограмм осуществляли с помощью алгорит- ма “neighbor-joining” (NJ) в программе MEGA 4. Статистическую достоверность филогенетиче- ских реконструкций оценивали методом “Boot- strap” путем построения 1000 альтернативных де- ревьев. Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК выделенных штаммов депонированы в GenBank NCIB с присвоением индивидуальных номеров доступа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Численность термотолерантных и термофиль- ных актиномицетов в пустынных почвах Монго- лии колеблется от тысяч до миллионов КОЕ/г почвы в зависимости от типа почвы и оказывает- ся сопоставимой с численностью мезофильных форм, чаще превышая последнюю (рис. 1а).
Из всех исследованных пустынных почв Мон- голии остепненно-пустынные светлобурые и та- кыровидная почвы характеризуются наиболее значительной численностью актиномицетов (до миллионов КОЕ/г). Очевидно, наибольшее, по сравнению с другими исследованными почвами, количество актиномицетов в этих почвах связано с большим количеством органических веществ (например, в такыровидной почве) или с более тя- желым гранулометрическим составом, обеспечи- вающим наиболее благоприятный для микроорга- низмов водно-воздушный и трофический режим (в остепненно-пустынной светлобурой средне- мощной суглинистой почве) (табл.1). Во всех ис- следованных почвах обнаружены термотолерант- ные и почти во всех – умеренные термофильные актиномицеты, по численности сопоставимые, а иногда и превышающие по количеству мезофиль- ные формы. Наибольшее количество термотоле- рантных и умеренных термофильных актиноми- цетов обнаружено в остепненно-пустынной среднемощной суглинистой почве, что, очевид- но, можно объяснить более значительным про- гревом суглинистых почв. Как правило, в акти- номицетных комплексах исследованных пустын- ных почв значительную долю, превышающую долю мезофильных актиномицетов, составляют термотолерантные и умеренные термофильные актиномицеты (рис. 1б).
Наиболее распространенными представителя- ми порядка Actinomycetales в пустынных почвах Монголии оказались роды Streptomyces и Mi) cromonospora. Стрептомицеты представлены как мезофильными, так и термотолерантными фор- мами. Микромоноспоры в актиномицетных ком- плексах почти всех исследованных пустынных почв представлены термотолерантными и термо- фильными формами (рис. 2).

1
2

Образцы почв
3
4
5
6
7
8
9
0 1 2 3
(а)

4 5 6

7 8
lg N

100%
90%

80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
(б)

1 2 3 4 5 6 7 8 9
Образцы почв

Рис.1. Численность (lgN) (а) и доля в актиномицетном комплексе (б) мезофильных, термотолерантных и умеренных термофильных актиномицетов в пустынных почвах Монголии. Здесь и на рис. 2: мезофильные актиномицеты–белые столбики; термотолерантные актиномицеты–заштрихованные столбики; умеренные термофильные актиномицеты– черные столбики. N – КОЕ/г почвы.

Из серо-бурой пустынной почвы выделен уме- ренный термофильный актиномицет, по феноти- пическим признакам и последовательности нук- леотидов в молекуле 16S рРРРНК идентифициро- ванный как Streptomyces sp. Последовательности гена 16S рРРРНК этого штамма депонированы в GenBank NCIB с присвоением индивидуального номера доступа Streptomyces sp. 315 FR716528.
Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК термотолерантного штамма 175, выделен- ного из бурой пустынной почвы и по фенотипи- ческим признакам и последовательности нуклео- тидов в молекуле 16S рРНК идентифицированно- го как Streptomyces tendae, депонированы в GenBank NCIB с присвоением индивидуального номера до- ступа Streptomyces tendae 175 FR846234.
В образце такыровидной пустынной почвы Монголии мезофильные актиномицеты представ- лены родом Streptomyces, термотолерантные – рода- ми Micromonospora, Actinomadura, Streptosporangium.
Термотолерантный штамм 392-1, выделенный из такыровидной пустынной почвы, идентифи- цирован по фенотипическим признакам и после- довательности нуклеотидов в молекуле 16S рРРРНК как Actinomadura sp. Нуклеотидные по- следовательности гена 16S рРРРНК этого штамма депонированы в GenBank NCBI с присвоением индивидуального номера доступа Actinomadura sp. 392-1 FR853173.
Из такыровидной пустынной почвы выделен термотолерантный штамм S341f, по фенотипиче- ским признакам и последовательности нуклеоти-

lg N 7
6

5
4

3
2
1

(а)

0
1 2 3 4

5 6 7 8 9

lg N 7
6

5
4

3
2
1

(б)

0
1 2 3 4 5 6

7 8 9

Образцы почв