|
Gramitsidan faolligini hisoblash:
o‘rtacha kattalik qiymatining absorbsiyasi har bir standart uchun ikki siklli yarim logarifmik grafikka chiqartiriladi. Unda absorbsiya - arifmktik shkala, konsentratsiya esa logarifmik shkala bilan belgilanadi. Namuna absorbsiyasining o‘rtacha kattaligi olinib, gramitsidin konsentratsiyasi esa standart egriligi balan hisoblanadi.
Namunadagi gramitsidin tarkibini olish uchun mos bo‘lgan suyultirish faktorini konsentratsiyaga ko‘paytirish orqali topiladi.
Ko‘rsatma:
Rossiya farmakopeyasiga binoan, agarga Bacillus cereus var mycoides 537 qo‘llab diffuziya qilish uculini gramitsidin faolligini aniqlash ham qo‘llanilishi mumkin.
Turbidimetrik va agarda diffuziya usullarida natijalarni farqlanishi kuzatilsa, turbidimetrik usuli tanlaniladi.
Framitsetin sulfat miqdoriy tarkibini aniqlash
Tekshirishlarni korxona usuliga mos keluvchi agarda diffuziya usulida aniqlaniladi.
Framatsidin sulfatni takribini namunadagi dori vositasida aniqlaniladi: 5 ml namunani mos keluvchi erituvchi bilaneritib 100 mg/ml framitsitin eritmasi olinadi, va qaytiiriladi.
Tahlil:
Agarda diffuziya usulida tekshiriliarni olib boriladi.
Kichik plastinalar usuli.
Dozalar nisbati 4:1.
Muhit:
1) Ushlab turuvchi muhit (Maintenance medium): A IP96 muhiti
2) Spora olish uchun muhit (Spore suspension medium): A IP96 muhiti
3) Faolligini aniqlash uchun muhit (Assay medium) :Oziqaviy agar ning rN kattaligi sterilizatsiyadan so‘ng 8,0±0,1.
Bufer eritmasi: 0,1 M fosfat buferi, rN 8,0.
Tayerlanishi:
16,73 g ikki o‘rinni bosuvchi kaliy fosfat
0,523 g bir o‘rinni bosuvchi kaliy fosfat
Yuqorida ko‘rsatilgan miqdordagilarni eritiladi va eritmaning hajmni 1000 ml gacha distillangan suv bilan etkaziladi. Eritmani rN kattaligini fosfor kislotasi yoki 10N kaliy gidroksid bilan aniqlashadi (rN kattaligi sterilizatsiyadan so‘ng 8,0±0,1).
Mikroorganizm – testini tayyorlash.
Sterilligini tekshirish uchun qattiq yopiilgan prbirkalarni inkubirlanadi, 24 soat davomida muhitni saqlanadi. Har bir probirkaga petli kosachasiga vegetativ organizmini engil sim orqali inokulyat ekiladi. Inkubatsiya jarayoni probirkalarda 16 soat mobaynida 37°S haroratda , so‘ng boshlang‘ich 4°S haroratda saqlanadi. Tarkibiy qatlamini Rouks bankasiga 250 ml muhit A ni 0,3 g/l magniy sulfat bilan inokulyasiya qilinadi.
Rouks bankasini inkubirlanishi 7 kun mobaynida 37°S haroratda olib boriladi. Agar sirtini 100 steril tozalangan suv bilan shishali dumaloqchalarni yordamchi suspenziya sifatida ishlatilib yuviladi. Buning natijasida suspenziyaga yig‘iladi.
Boshlang‘ich suspenziyani suv hammomida 30 daqiqa mobaynida 60°S haroratda qizdiriladi va 4°S haroratda saqlanadi. Bu jarayonni 3 kun mobaynida qaytiriladi. Bu suspenziya 3 oy davomida ishlatiladi. Ishlatishdan oldin boshlang‘ich suspenziyani 60% darajasida suvni o‘taqazishigcha suyultirilib 580 nm to‘lqin uzunligida mos bo‘gan kalorimetrda tekshiriladi.
Framitsitin sulfat standarti (har yildagi tayyorlanish:)
Framitsit sulfatga mos bo‘lgan miqdorda 10 g (10 g atrofida) Noecht Marin Roussel dan olib kelingan, partiyadan tanlab olinib, tashqi standart sifatida belgilanadi.
Tashqi standart standartlashda Noecht Marin RousselReference standartini ishlatib, tashqi standart sifatida belgilanadi.
Boshlang‘iya standart eritmasi:
aniq tortma olinadi va framitsit sulfatga mos bo‘lgan miqdorda (tashqi standart) steril tozalangan suvda shunday eritiladi 1000mg / ml boshlang‘ich eritmasi standart eritmasiga o‘xshab belgilanishi kerak bo‘ladi.
Framitsitin sulfat standartining ishchi eritmasi (har haftadagi tayyorlanish:)
10 ml standart eritmasni mos bo‘lgan bufer eritmasi bilan rN=8,0 bo‘lgan, 50 ml o‘lchov kolbasida (200 mg/ml) eritiladi.
Framitsitin sulfat standartieritmasini yuqori va past konsentratsiyasi (har kundagi tayyorlanish:)
2,5 ml (200 mg/ml) standart eritmasini fosfat buferi bilan rN=8,0 bo‘lgan, 25 ml o‘lchov kolbasida (20 mg/ml) eritiladi. (SN)
2,5 ml (200 mg/ml) standart eritmasini fosfat buferi bilan rN=8,0 bo‘lgan, 100 ml o‘lchov kolbasida (5 mg/ml) eritiladi. (SL)
Framitsitin sulfat ishchi standartining 20 mg/ml va 5 mg/ml konsentratsiyali eritmalarini ishchi doza uchun miqdoriy tahlilda ishlatiladi. Faollikni aniqlash uchun dozar nisbati 4:1.
Tekshirilayotgan eritmani tayyorlash.
Tekshirilayotgan eritma namunasining ekstraktini 0,1M fosfat buferida suyultirilib, rN=8,0 bo‘lgan 20 mg/ml konsentratsiyasi olinadi. Olingan eritmani yuqori konsentratsiyali ishchi eritma sifatida ishlatiladi. (TN) So‘ng yana tekshirilayotgan eritma namunasining ekstraktini 0,1M fosfat buferida suyultirilib, rN=8,0 bo‘lgan 5 mg/ml konsentratsiyasi olinadi.Olingan eritmani past konsentratsiyali ishchi eritma sifatida ishlatiladi. (TL)
Sterillangan Petli likopchasini (tashqi diametri 9 sm bo‘lgan) avtoklavda 20 daqiqa mobaynida 121°S haroratda ishlov beriladi.
Muhit eritiladi 60°S gacha sovutiladi va 13 ml muhitni har bir plastinkagalarga taqsimlanadi. Har bir namuna uchun minimal 4 ta plastina ishlatiladi. Qatlam asosni qotishini kutiladi. Qlogan muhitni 60 °S haroratda ushlab turilib 1% li B. Subtilis ATSS 6633 suspenziyaga ekiladi.
Aylanma holatda yaxshilab arlashtiriladi va 4 mldan ikkinchi qatlamga inokulyasiyalangan muhitni solinadi, asosiy qatlamni bir xil taqlash kerak bo‘ladi. Muhitni quyuqlashini kuzatiladi.
Plastinkada bir hil masofada taqsimlab o‘lchami 8 mm misli probkalar orqali 4 ta chuqurchalar hosil qilinadi va agar muhitidan kesib olingan bo‘laklar yo‘qotiladi.
50 mkl standart yuqori va past konsentratsiyali eritmadan bir biridan diagonal joylashgan chuqurchalarga solib qo‘yiladi.
50 mkl standart yuqori va past konsentratsiyali eritmadan qolgan ikki chuqurchalarga solib qo‘yiladi. Buning natijasida, standart va ishchi eritmalar turli xil chuqurchalarda bitta plastinkada joylashadi. Plastinkalarni xona haroratida 60 daqiqa qo‘yib qo‘yiladi, so‘ng 18 soat mobaynida 37°S haroratda inkubirlanadi va inkubatsiyalangan muhitni diametrini antibiotiklarni muhitini chegarasini o‘lchovchi asbob orqali hisoblab topiladi. Natijalarni kompyuter orqali to‘g‘rilanadi va tekshiriluvchi namunaning faolligini foizlarda hisoblab topiladi.
Hisoblash:
% Faolligi =Antilog 2 ± a log I
bu erda:
I = doza nisbati = SH:SL
foiz tarkibini aniqlanishi
Saqlanish muhiti (A IP 96 muhiti:)
Pepton 6,0 g
Pankreatik kazein sho‘rvasi 4.0g
Achitqi ekstrakti 3.0 g
Go‘sht ekstrakti 1,5 g
Dekstroza 1,0 g
Agar 15.0g
Distillangan suv 1000 ml
Sterilizatsiya qilingandan
so‘ng pH kattaligi: 6.55 ±0,05
Spora olish uchun muhit (A IP 96 muhiti:)
Saqlanish muhiti (A IP 96 muhiti:)
Pepton 6,0 g
Pankreatik kazein sho‘rvasi 4.0g
Achitqi ekstrakti 3.0 g
Go‘sht ekstrakti 1,5 g
Dekstroza 1,0 g
Marganets sulfat 300 mg
Agar 15.0g
Tozalangan suv 1000 ml
Sterilizatsiya qilingandan
so‘ng pH kattaligi: 6.55 ±0,05
Anitibiotik foallini aniqlash uchun muhiti (A IP 96 muhiti:)
Pepton 6,0 g
Achitqi ekstrakti 3.0 g
Go‘sht ekstrakti 1,5 g
Natriy xlorid 5,0 g
Agar 15.0g
Distillangan suv 1000 ml
Sterilizatsiya qilingandan
so‘ng pH kattaligi: 8,0 ±0,1
Framitsitin sulfat faolligini agardagi diffuziya usuli orqali aniqlash
Framitsetin sulfatni standartini yozish:
100 mg
(670 TB/mg)
10 ml
2.5 ml
100ml
|
100 ml (Steril tozalangan suv)
50 ml
25 ml
100 ml
|
Bufer
rN=8,0
Bufer
rN=8,0
Bufer
rN=8,0
|
1000 mkg/ml
200 mkg/ml
20 mkg/ml
SH
5 mkg/ml
SL
|
Tekshirilayotgan namunani yozish (jadvalni davomi):
2 ml
2.5 ml
2.5 ml
|
50 ml
25 ml
100 ml
|
Bufer
rN=8,0
Bufer
rN=8,0
Bufer
rN=8,0
|
200 mkg/ml
20 mkg/ml
SH
5 mkg/ml
SL
|
Do'stlaringiz bilan baham: |
