|
Двухступенчатое получение аминокислот из биосинтетических
предшественников выбирают в тех случаях, когда предшественник недо-
рог, а прямая микробная ферментация недостаточно экономична или раз-
работана. При микробиологическом синтезе аминокислот из предшест-
венников удается значительно понизить репрессию или ретроингибирова-
64
ние, так как в результате внесения в среду готового интермедиата снима-
ются проблемы, связанные с наличием генетического контроля в системе
синтеза аминокислот.
При двухступенчатом способе получения глутаминовой кислоты из
α-
кетоглутаровой, играющей роль предшественника, необходим источник
данного предшественника и ферментная система, катализирующая пре-
вращение кетоглутарата в целевую аминокислоту. Кетоглутарат получают
микробиологическим синтезом на основе бактерий (Pseudomonas,
Escherichia) или дрожжей (Candida) – I ступень. На II ступени можно по-
лучить L-глутаминовую кислоту в реакции восстановительного аминиро-
вания с помощью культуры Pseudomonas, имеющей сильную глутаматде-
гидрогеназу:
α-кетоглутаровая кислота + NН
4
+ НАДН
→
→ L-глутаминовая кислота + Н
2
О + НАД
+
.
L-глутаминговая кислота также может быть получена из кетоглутарата
через переаминирование последней с участием трансамидазы:
α-кетоглутаровая кислота + аминокислота →
→ L-глутаминовая кислота +α-кетокислота;
II ступень по данной схеме может быть реализована культурой E.
coli, в качестве донора аминогрупп могут выступать аланин или аспара-
гиновая кислота.
Комбинированный, принципиально новый способ получения L-лизина
в 1973 г. был предложен японской фирмой «Тойо Рейон» («Торей»). Ко-
нечный продукт, получаемый по данной технологии, отличается высокой
концентрацией и чистотой. На первой стадии циклогексан в результате
химических реакций превращается в циклический ангидрид лизина (D, L-
α-амино-ε-капролактам). На второй стадии осуществляют разделение оп-
тических изомеров с помощью ферментов; происходящий при этом асим-
метрический гидролиз с участием гидролазы аминокапролактама приво-
дит к образованию L-лизина. Гидролазу L-
α-амино-ε-капролактама синте-
зируют дрожжи (Candida, Trichospora, Cryptococcus), фермент стимулиру-
ется ионами марганца, магния и цинка. Источником рацемазы аминока-
пролактама могут служить бактерии (Flavobacterium, Achromobacter). Оба
эти фермента, обладающие рацемазной и гидролазной активностями, в
виде определенного количества биомассы вводят на II ступени в водный
раствор предшественника – DL-аминокапролактама. В ходе ферментатив-
ных реакций из предшественника образуется L-лизин, чистота препарата –
выше 99 %. Помимо микробной биомассы, источником превращений DL-
аминокапролактама в лизин могут служить изолированные иммобилизо-
ванные ферменты. Раствор предшественника пропускают через колонку,
содержащую оба иммобилизованных фермента: один из них (гидролаза)
гидролизует амидную связь в L-аминокапролактаме, не затрагивая D-
65
формы предшественника; второй (рацемаза) – превращает D-изомер в ра-
цемат с высокой скоростью. Выход L-лизина может составлять до 95 %.
L-триптафан также можно получать из предшественника – антранило-
вой кислоты. На первом этапе по традиционной микробиологической схе-
ме с использованием дрожжей Candida utilis в течение 20–24 ч проводят
процесс ферментации в условиях интенсивной (около 7 г О
2
/л.ч) аэрации.
Среда содержит мелассу (10.4 %), мочевину, сульфат магния, фосфаты
калия. Для пеногашения используют кашалотовый жир и синтетические
кремнеорганические соединения. Далее интенсивность аэрации снижают
вдвое, в культуру периодически вносят растворы мочевины, мелассы и
антраниловой кислоты. В течение 22–24 ч наращивают биомассу – источ-
ник ферментов; затем, в течение последующих 120 ч происходит собст-
венно трансформация антраниловой кислоты в аминокислоту. Общее вре-
мя процесса составляет около 140 ч, выход триптофана – 60 г/л.
Большие успехи в биотехнологии аминокислот были достигнуты с
формированием методов инженерной энзимологии, в частности, с разви-
тием техники иммобилизации ферментов.
Первым процессом промышленного использования иммобилизован-
ных ферментов был процесс для разделения химически синтезированных
рацемических смесей D- и L-форм аминокислот, разработанный в Японии
в 1969 г. (предыдущие 15 лет процесс проводился компанией «Танабе
Сейяку» с применением растворимых ферментов – аминоацилаз). В каче-
стве исходного материала используют раствор ацилпроизводных синтези-
рованных химическим путем LD-форм аминокислот, который пропускают
через колонку с иммобилизированной L-аминоацилазой. Последняя гид-
ролизует только ацил-L-изомеры, отщепляя от них объемную ацильную
группу и тем самым резко увеличивает растворимость образующейся L-
аминокислоты по сравнению с присутствующими в реакционной смеси
ацил-D-изомерами. Далее смесь легко разделяется обычными физико-
химическим методами. Компанией на промышленном уровне по данной
технологии реализован синтез нескольких L-аминокислот, в том числе
метионина, валина, фенилаланина, триптофана. Представляет интерес
процесс получения аспарагиновой кислоты из химических предшествен-
ников (фумаровой кислоты и аммиака) на основе фермента аспартазы,
разработанный японской фирмой «Танабе Сейяку». Фермент в одну ста-
дию присоединяет молекулу аммиака к двойной связи фумаровой кислоты
с образованием оптически активной L-аспарагиновой кислоты. Выход
продукта составляет 99 %, процесс реализуется непрерывно в колонке
объемом 1 м
3
. Производительность достигает 1700 кг чистой L-аспараги-
новой кислоты в день на один реактор.
Дегидрогеназы аминокислот (лейцин- и аланиндегидрогеназы), катали-
зирующие обратимые реакции дезаминирования, применяют в непрерыв-
ных процессах синтеза аминокислот из соответствующих кето-аналогов.
66
Глутаматсинтетаза, катализирующая АТФ-зависимую реакцию аминиро-
вания глутамата, используется для получения глутамина с 92 % выходом.
L-тирозин-фенол-лиаза, катализирующая реакцию элиминации, в которой
тирозин распадается с образованием фенола, аммиака и пирувата, исполь-
зуется для энзиматического получения последнего. L-триптофан-индол-
лиаза может быть использована для получения L-триптофана из индола,
пирувата и аммиака.
Высокая потребность в аминокислотах непрерывно стимулирует раз-
работку принципиально новых и более эффективных биотехнологических
способов их получения при наращивании темпов и объемов промышлен-
ного производства.
Do'stlaringiz bilan baham: |
