Biologik to’qimalardan genom dnksini ajratish usullari

Biologik to’qimalardan genom DNKsini ajratish usullari
Ishdan maqsad: STAB metodi yordamida o’simlik to’qimalaridan genom DNK ajratishni o’rganish.
Kerakli asbob va uskunalar:
-xovoncha yoki probirka (1500-2000 mkl) va stikchalar
-taglik (96 talik)
-sentrifuga
-muzlatgich
-65 ⁰C avtoblot va vorteks
-kontsentrator
-rezina qo’lqop konchiklar (100,200 va 1000 mkl)
Kerakli reagentlar
-suyuq azot
-2x lik STAB
-10x lik STAB
-xloroform:izoamil (24:1)
-STAB precipitation
-High salt RNA ase (50 ml:200 mkl)
-izapropanol
-TE buffer
Ishning mazmuni: Bugungi kunda o’simlik DNK sini ajratish va tozalashning juda ko’plab usullari mavjud va bu usullar yangi tadqiqot ob’yektlariga nisbatan takomillashtirilib, o’zgartirilmoqda. DNK ekstraktsiyasining bir yoki boshqa usulini qo’llash, birinchi navbatda, o’rganilayotgan materialning o’ziga xosligi bilan belgilanadi va ikkinchidan, qanday maqsad bilan amalga oshirilishiga bog’liq: umumiy, yadroviy, xloroplast DNK ni yoki boshqa preparatlarni olish.
Yadroviy DNK, qoida sifatida, eng katta qiziqishdir, chunki u genlarning transkriptsiyasi uchun shablon sifatida xizmat qiladi. DNK ning ekstraktsiyalash usuli nisbatan sodda, yaxshi qayta ishlab chiqilishi va yetarli miqdorda qoniqarli tozalangan DNK preparatlarini tez ishlab chiqarish imkonini berishi kerak. O’simliklardan DNK ni izolyatsiya qilganda, o’simlik materiallarida kam DNK tarkibiga, hujayralarni yo’q qilish qiyinligiga va shuningdek, DNK ni tozalashni qiyinlashtiradigan ko’p miqdorda iflosliklar (polisaxaridlar, pigmentlar, taninlar) bilan bog’liq bir qator metodologik qiyinchiliklarga duch kelinadi.
DNK rentabelligi manba moddasining tabiatiga bog’liq va bu to’qimada DNK ning tarkibi, shuningdek, DNK ni tozalashga xalaqit beruvchi aralashmalar mavjudligi va tabiati bilan belgilanadi. O’simlik DNK rentabelligi odatda hayvonlarning to’qimalariga nisbatan pastroq bo’ladi (masalan, DNK ni yangi barglardan ajratishda 0,1 mg/g barglarga erishish mumkin). Olingan DNK preparatining sifati keyingi ishlarning vazifalari bilan belgilanadi. Har qanday holatda, DNK da preparatlarning spektral xarakteristikalari - A260 / A230 ≥ 2.0, A260 / A280 ≥ 1.8-1.9. PHK ning sof DNK preparatlaridagi tarkibi 2-3 foizdan oshmasligi kerak.
Olingan har qanday DNK mahsuloti tozaligi, o’ziga xosligi va polimerizatsiyasi uchun aniq mezonlarga muvofiq bo’lishi kerak. Mitoxondriyadan va o’simlik hujayralarining plastidlaridan DNK ni juda aniqlik bilan olish uchun yosh to’qimalardan va yuqori o’simliklarning organlaridan (masalan, ko’chatlar) ajratish juda qulaydir. Ba’zi hollarda barglar ko’p miqdordagi eng ko’p ishlatiladigan o’simlik organi hisoblanadi. Shu bilan birga, o’simliklardan yuqori darajada tozalangan DNK preparatlarini olishda ko’rinadigan qiyinchiliklar ham avval barglar bilan ishlaganda uchraydi. Jami DNK ni barglardan ajratganda, bu holda DNK ning bir qismi xloroplast DNK bilan ifodalanishini hisobga olish kerak. Katta yaproqlar yadrodan ko’ra ikki barobar ko’p miqdorda xloroplast DNK ni o’z ichiga oladi. O’rta barglar uchun xloroplast DNK miqdori taxminan yadro DNK si bilan bir xil, kichik yaproqlar uchun DNK ning uchdan bir qismi xloroplastlarda bo’ladi. DNK ni ajratishda muzlatilgan suyuq azot bilan yangi o’simlik materiallaridan ajratib olish afzalroqdir. Muzlatilgan suyuq azot to’qimalari va o’simlik a’zolari ba’zan -20° C da DNK ekstraktsiyasiga qadar saqlanadi.
Ishni bajarish tartibi:
Barg suyuq azotda muzlatilib, gomogenizatsiya qilinadi (1-rasm).
600 mkl 2xSTAB solinadi va 60⁰ C avtoblotga 20 minutga qo’yiladi (har 5 minutda aralashtiriladi).
Ustiga 600 mkl xloroform:izoamil (24:1) solinib, 2 minut qattiq aralashtiriladi.
5 minut/10 000 aylanmada sentrifuga qilinadi va supernatantning yuqorisidan 600 mkl boshqa probirkaga olinadi.
Ustiga 60 mkl 10x STAB solinib aralashtiriladi.
Keyin ustiga 600 mkl xloroform:izoamil (24:1) solinib, 2 minut qattiq aralashtiriladi.
5 minut/10 000 aylanmada sentrifuga qilinadi va supernatantning yuqorisidan 600 mkl boshqa probirkaga olinadi.
Ustiga 1:1 nisbatda STAB precipitation solinadi va 60⁰ C avtoblotga 30 minutga qo’yiladi.
3 minut/14 000 aylanmada sentrifuga qilinadi va supernatant to’kiladi.
Cho’kma ustiga 300 mkl High salt solinadi va 5 minut vorteks qilinib, so’ng 15 minut xona haroratida saqlanadi.
Ustiga 180-200 mkl izopropanol solinadi va 2 minut sekin aralashtiriladi. Keyin -20⁰ C ga 20 minut qo’yiladi.
15 minut/10 000 aylanmada sentrifuga qilinadi va supernatant to’kiladi.
Cho’kma ustiga 600 mkl 70 % li spirt solinib, 5 minut aralashtiriladi.
3 minut/14 000 aylanmada sentrifuga qilinadi va spirt to’kiladi. (cho’kma spirt bilan 2 marta yuviladi).
Cho’kma, ya’ni DNK kontsentratorda 10-15 minut quritiladi.
Cho’kma ustiga 100 mkl TE bufferi solinib, vorteks qilinadi, short sentrifuga qilinadi va 20⁰ C muzlatgichga qo’yiladi.

1-rasm. Bargni gomogenizatsiya qilish jarayoni
Nazorat savollari va topshiriqlar
DNK ni ajratish va tozalashda qaysi usuldan foydalanish nimaga asoslanadi?
DNK ni juda aniqlik bilan olish uchun o’simliklarning qaysi organlaridan ajratish juda qulay?
O’simlik to’qimalaridan genom DNK ajratishda ishlatiladigan asbob va jihozlarni ayting va ular qanday funktsiya bajaradi?
DNK ajratish uchun namunalar yig’ish qanday amalga oshiriladi?
DNK ajratish uchun qanday buferlar ishlatiladi?
STAB metodi yordamida o’simlik to’qimalaridan genom DNK ajratishda qaysi asbob va uskunalardan foydalaniladi?
O’simlik to’qimalaridan genom DNK ajratishda kerakli reagentlar?
Genomikadan amaliy mashg’ulotlarda foydalaniladigan barcha asbob va uskunalarning ishlash tartibini va uning nima maqsadda ishlatilishini o’rganing.
Genom DNK sini ajratish uchun tuzilgan protokolni yaxshilab o’rganing va o’zlashtiring.
DNK ajratish uchun buferlar tayyorlash va genom DNK sini ajratish bo’yicha tuzilgan protokollarni daftarga yozing va amalda bajarishni o’rganing.
Organizmlardagi irsiyat va irsiylanish murakkab molekulyar-genetik jarayonlar majmuasi orqali amalga oshiriladi.
DNK-dezoksiribonuklein kislota molekulasi barcha eukariot va aksariyat prokariot organizmlarda ularning belgi va xususiyatlarining kelgusi avlodlarga irsiylanshi va rivojlanishini ta’min etuvchi genetik axborot nukleotid tripletlar-kodonlar joylashish tartibi orqali ifodalangan biopolimerlar hisoblanadi. RNK-ribonuklein kislotasi kelgusi avlodlarga irsiylangan genetik axborotning fenotip tarzida namoyon bo‘lishini ta’min etadi.
DNK molekulasining strukturasini va uning molekulyar modelini 1953 yilda amerikalik biolog olim Dj.Uotson va ingliz fizik olimi F.Kriklar M.Uilkinzning DNK ning rentgen strukturaviy tahlil dalillariga tayanib kashf etdilar. Ularning uchchalasi ham 1962 yilda Nobel mukofotiga sazovor bo‘ldilar. Molekulyar genetika dalillariga binoan DNK molekulasining tuzilishini quyidagicha tasvirlash mumkin:
DNK molekulasi polinukleotid biopolimer bo‘lib, uning tarkibida 4 xil nukleotidlar mavjud. Har bir nukleotid 3xil kimyoviy birikmadan tashkil topgan bo‘ladi: uglevod-monosaxarid-pentozalar jumlasiga kiruvchi dezoksiriboza, fosfor kislotasi, azot asosi. Azot asoslari 4 xil bo‘ladi. Ularning ikkitasi purin asoslari: adenin-A (A), guanin-G (G), qolgan ikkitasi pirimidin asoslari bo‘lib, ularga timin-T (T), sitozin-S (S) kiradi. tarkibiga ushbu azot asoslari kirgan nukleotidlar shu modda nomi bilan ataladi, ya’ni adenin nukleotidi, guanin nukleotidi, timin nukleotidi va sitozin nukleotidi. Ushbu nukleotidlar muayyan sonda va muayyan ketma-ketlikda bir chiziq bo‘ylab o‘zaro tutashib ayrim polinukleotid zanjirlarini hosil qiladi.
DNK molekulasi spiralsimon o‘ralgan ikkita polinukleotid zanjiridan iborat biopolimerdir.
DNK dagi bu ikkita polinukleotid zanjiridagi nukleotidlar bir-biri bilan vodorod bog‘lari orqali tutashishi komplementarlik qoidasiga binoan amalga oshadi. Bunda adenin nukleotidi (A) timin nukleotidi (T) bilan, guanin nukleotidi (G) sitozin (C) nukleotidi bilan tutashadi. DNK molekulasining diametri 20 angstrem bo‘lib, A va T li nukleotidlar uzunligi 12 angestrem va nihoyat G va S li nukleotidlar 8 angestremga teng.
DNK molekulasi tarkibidagi dezoksiriboza va fosfatlar bir-biri bilan ketma-ket tutashib aylanma (spiralsimon) narvonga o‘xshash qurilmaning ikki tayanch ustunchasini hosil qiladi. A va T, G va S linukleotidlar o‘zaro tutashib DNK aylanma narvonning zanapoyalarini hosil qiladi.
DNK molekulasidagi ikkala spiralsimon polinukleotid zanjiri DNK molekulasining yagona umumiy o‘qi atrofida spiralsimon aylanib joylashgan bo‘ladi. U fazoviy o‘qqa nisbatan o‘ngga buralish xususiyatiga ega. Spiralning ichki qismidagi azot asoslari fazoviy o‘qqa nisbatan perpendikulyar joylashgan. Qo‘sh spiraldagi har bir zanjir o‘zaro antiparallel, ya’ni uning kimyoviy tuzilishi bir-biriga qarama-qarshi holda shakllanadi. Bir zanjirdagi bog‘ 5’-3’ shaklida bo‘lsa, ikkinchisida, aksincha 3’-5’ fosfat ko‘rinishida bo‘ladi.
DNK o‘zining replikatsiyalanish xususiyatidan kelib chiqib, genetik axborotni o‘zgarmas holda hujayradan hujayraga va organizmdan organizmga irsiylanish va saqlanishini ta’minlash, hujayrada bo‘ladigan transkripsiya va translyatsiya jarayonlarini boshqarib turish kabi vazifalarni bajaradi [1].
DNK ning o‘ziga xos xususiyatlariga quyidagilar kiradi:
Denaturatsiya;
Renaturatsiya;
Gibridizatsiya;
Destruksiya;
Replikatsiya;
Reparatsiya;
Transkripsiya;
Rekombinatsiya;
Mutatsiya.
Denaturatsiya. O‘zaro vodorod bog‘lari orqali bog‘langan DNKning ikki zanjirli strukturasi oson buzilishi mumkin. DNK polinukleotid zanjirlari o‘rtasidagi vodorod bog‘larni kuchli ishqorli eritmalar (rN>12,5) yoki harorat (+95oS) ta’sirida uzish mumkin. Bunda DNK zanjirlari butunlay ikkiga ajraladi. Bu jarayon denaturatsiya deb nomlanadi.
Renaturatsiya. Denaturatsiya jarayoni qayta tiklanuvchi jarayon bo‘lib hisoblanadi. Ikkiga ajralgan komplementar ikki zanjir strukturasining qayta tiklanish holati, ya’ni polipeptid zanjirining qayta tiklanishi DNK renaturatsiyasi deb nomlanadi. Renaturatsiyani amalga oshirishi uchun denaturatsiyalangan DNK eritmasini sovutishning o‘zi kifoya.
Gibridizatsiya. Renatursiya jarayonida denaturatsiya jarayonida ikkiga ajralgan komplementar ketma-ketliklar ishtirok etadi. Biroq, turli xil komplementar ketma-ketliklar ham ikki zanjirli strukturani renaturatsiyalashi mumkin. Turli moddalardan olingan bir zanjirli DNK molekulalarini renaturatsiya qilinganda ikki zanjirli DNK molekulasini hosil bo‘lish jarayoni gibridizatsiya deb nomlanadi.
Destruksiya-DNK birlamchi strukturasining tiklab bo‘lmas darajada buzilishi.
Replikatsiya. DNK matritsasida DNK molekulasining ikki martadan ko‘payish jarayoni replikatsiya deb nomlanadi. Replikatsiya jarayonining ketishi uchun bir zanjirli DNK-matritsa, dezoksinuklezidtrifosfatlar, fermentlar, magniy ionlari va ikki zanjirli DNK molekulasini bir-biridan ajratuvchi oqsil omillari bo‘lishi zarur. Replikatsiya jarayoni initsiatsiya, elongatsiya va terminatsiya bosqichlarini o‘z ichiga oladi.
Reparatsiya. Makromolekula bo‘lgan DNK zanjirining matritsali sintezi bo‘lmish replikatsiya jarayonining biror nuqtasida ketgan molekulyar xatoliklarni DNK polimeraza, DNK ligaza fermentlari orqali tuzatilib ketish jarayoni reparatsiya deb nomlanadi.
Transkripsiya. DNK dan RNK sintezlanish jarayoni, ya’ni DNK molekulasidagi nukleotidlar tartibi shaklida yozilgan axborotni ko‘chirib olish jarayoni transkripsiya deb nomlanadi. Transkripsiya jarayonida 3 turdagi RNK sintezlanadi. RNK sintezi RNK polimeraza fermenti ishtirokida amalga oshadi. Transkripsiya jarayoni ham initsiatsiya, elongatsiya va terminatsiya bosqichlarini o‘z ichiga oladi.
Rekombinatsiya. Turli molekulalarni parchalanishi va birikishi yo‘li bilan genetik material almashinish jarayoni bo‘lib hisoblanadi. Rekombinatsiya DNK ikki zanjiridagi uzilishlar reparatsiyasi vaqtida bo‘ladi. Eukariotlarda rekombinatsiya odatda meyoz jarayonidagi krossingoverda, xususan, hayvonlarda spermatozoidlar va tuxum hujayralar shakllanish vaqtida sodir bo‘ladi.
Mutatsiya. Genomning turg‘un o‘zgarishi mutatsiya deyilib, indutsirlangan va spontan mutatsiyalarga bo‘linadi. Spontan mutatsiyalar organizmning butun hayoti davomida atrof muhitning normal sharoitida o‘z-o‘zidan paydo bo‘ladi. Indutsirlangan mutatsiyalar esa sun’iy (eksperimental) va atrof-muhitning salbiy ta’sirlari (mutagenlar) natijasida kelib chiqqan genom o‘zgarishlari hisoblanadi. Mutatsiyani keltirib chiqaradigan asosiy jarayonlarga DNK replikatsiyasi, DNK reparatsiyasining buzilishi, DNK transkripsiyasi va genetik rekombinatsiya kiradi.
Yadroviy (xromosoma) va mitoxondrial DNK lokuslari (qismlari) kriminalistik DNK tadqiqotlarida qo‘llaniladigan asosiy diagnostik element bo‘lib hisoblanadi. Odamning har bir diploid hujayrasi taxminan 5-6 pg summar (total) DNK ga ega bo‘lib, uning asosiy massasini yadroviy DNK tashkil qiladi va ushbu umumiy DNK ning taxminan 1% i mitoxondrial DNK molekulasiga to‘g‘ri keladi.
Yadro genomini tashkil qiluvchi DNKning barcha ketma-ketliklari uncha ko‘p bo‘lmagan xromosomalarda jamlangan. Odamda bunday xromosomalar 23 (oddiy hujayralarda har bir xromosoma juft gomologik xromosomalarga ega bo‘lib, ular umumiy 46 ta xromosomani hosil qiladi) tani tashkil etadi. Xromosomada DNK ketma-ketliklari bir tekis joylashgan bo‘lib, bunda har bir maxsus ketma-ketlik (genetik belgi) lokus deb nomlanuvchi xromosomaning ma’lum bir qismini egallaydi. Lokuslar xromosomada bir-biriga yaqin masofalarda joylashgan bo‘lib, bir-biri bilan birikkan holda irsiylanishi mumkin.
Turli individlarda bir xil genetik belgilar odatda alternativ shakllari orqali ifodalanadi, bu esa bu individlar fenotipik belgilarining o‘zaro farqlanishini keltirib chiqaradi. Mazkur shakllar allellar deb nomlanadi. Bir belgining turli allellari har doim bir lokusda joylashadi. Populyatsiyada bir lokusning bir nechta turg‘un allellarining bo‘lishi polimorfizm deb ataladi, bunday lokus esa-polimorf deb nomlanadi. Bir individumning har bir genetik belgisi ikkita allel (genomda har bir xromosoma gomologik xromosomalar juftidan iborat bo‘lgani uchun) ko‘rinishida bo‘ladi: allellar bir xil bo‘lsa, bunday genetik belgi gomozigot holat bilan, agar allellar turli xil bo‘lsa geterozigot holat bilan ifodalanadi.
Polimorf lokuslar allel variantlari yig‘indisi har bir odam uchun individual xususiyatga ega(2).
Molekulyar genetik tadqiqotlar jarayonida qo‘llaniladigan markerlar.
Yadro DNK markeri
DNKning o‘ziga xos ketma-ketliklari organizmning barcha genlarini, ya’ni nukleotid ketma-ketligida ma’lum bir genetik axborot kodlangan DNK qismlarini o‘z ichiga oladi. Genom DNKsining o‘ziga xos polimorfizmi bir lokus turli allellari nukleotid ketma-ketliklaridagi farq bilan izohlanadi. Polimorfizmning bunday turi nukleotid ketma-ketligidagi polimorfizm deb nomlanadi.
Ekspertiza amaliyotida serologik usullar (masalan, AVO qon guruhi tizimi) bilan tekshiriladigan genetik markerlar belgilarini kodlaydigan DNK maydonlari mazkur polimorfizm turi bilan izohlanadi.
DNKning ko‘p marta takrorlanuvchi qismlari genomda ko‘p marta tandem ravishda takrorlanuvchi ketma-ketliklari, ya’ni tandem takrorlanishlar ko‘rinishida joylashgan bo‘lib, ular tuzilishi bo‘yicha bir-biriga o‘xshash yoki aynan bir xil bo‘lishi mumkin. Tandem takrorlanishlar qismlari yuqori darajadagi polimorfizmga ega bo‘lib, ular takrorlanuvchi birliklar domiy emasligi bilan xarakterlanadi, bu esa bir lokusdagi allellar uzunligi bo‘yicha bir-biridan farqlanadi. Bunday polimorfizm turi uzunlik polimorfizmi deb nomlanadi.
Tandem takrorlanishlar lokuslari ikki guruhga bo‘linadi:
–minisatellitlar yoki VNTR-lokuslar(Variable Tandem Repeat-o‘zgaruvchan tandem takrorlanishlar soniga ega bo‘lgan lokus) bo‘lib, ular 10 tadan 60 tagacha bo‘lgan nukleotid juftliklaridan iborat bo‘lgan uzunlikka ega bo‘ladi;
–mikrosatellitlar yoki STR lokuslar (Short Tandem Repeat-qisqa tandemli takrorlanish lokuslari) 4 tadan 30 tagacha bo‘lgan nukleotid juftligidan iborat bo‘ladi [3].
DNKning kriminalistik tekshiruvlarining rivojlanish jarayonida VNTR-lokuslardan genetik markerlar sifatida foydalanish ularning samaradorligining va ishonchlilik darajasining pastligini ko‘rsatdi.
Y-xromosoma markeri.
Odam Y-xromosomasi 59 milliondan ortiq nukleotid juftligiga ega bo‘lib, hujayra yadrosidagi umumiy DNKning deyarli 2 % ini tashkil etadi. Y-xromosoma 23 oqsilni kodlaydigan 86 dan ortiq genni o‘z ichiga oladi [3]. Y-xromosomadagi eng ahamiyatli bo‘lgan gen SRY geni bo‘lib, u organizmning erkak jinsi bo‘yicha rivojlanishini genetik jihatdan ta’min etadi.
Y-xromosomaning asosiy biologik funksiyasi-jinsni belgilash bo‘lib, u SRY (sexdetermining region Y)-genining ta’siriga ko‘ra bajarib, uning vazifasi urug‘donlar rivojlanishiga javob beradigan genlar transkripsiyasini boshqarish hisoblanadi. Uzoq vaqtlar davomida Y-xromosomaning gen va genetik markerlari kam degan fikr ilgari surilar edi. SRY genidan tashqari Y-xromosomada faqatgina spermatogenezda ishtirok etuvchi bir nechta genlargina joylashganligi aniqlangan edi. Biroq so‘nggi yillarda Y-xromosoma bilan birikkan ko‘plab genlar mavjudligi aniqlandi, ularning ko‘pchiligi fundamental hujayra jarayonlarida ishtirok etadi.
Y-xromosoma o‘z xususiyatlaridan kelib chiqqan holda odam genomidagi eng sirli va paradoksal xromosoma bo‘lib hisoblanadi. Jins determinatsiyasini aniqlash vazifasi bilan birga Y-xromosomaning gaploidligi va ota avlod bo‘yicha irsiylanishi uning genetik o‘ziga xosligini belgilaydi. Birichidan, bu xromosoma hujayrada doimiy ravishda gaploid xolatda bo‘ladi, ikkinchidan rekombinatsiyada ishtirok etmaydi (katta bo‘lmagan psevdoautosom qismlaridan (PAR-Pseudo Autosomic Region) tashqari). Y-xromosomaning rekombinatsiyaga uchramaydigan qismining (NRY-Non Recombinant Y-autosome) genetik variabelligi faqatgina mutatsion jarayon orqali aniqlanadi [4]. Bir ota avlodning bir necha o‘n bo‘g‘inidan bittasida mutatsion jarayonning namoyon bo‘lishi ota avlod bo‘yicha genetik o‘ziga xosligini uzoq muddat davomida saqlashini ko‘rsatadi, bu esa insoniyatning erkak genlari majmuasini molekulyar evolyusiyasini aniq rekonstruksiya qilish imkoniyatini beradi. Y-xromosoma liniyasi ona avlod bo‘yicha o‘zaro qarindoshlikni aniqlovchi mtDNK liniyasining analogi bo‘lib hisoblanadi. Lekin o‘lchami 16 ming nukleotid juftidan iborat bo‘lgan va nuqtaviy mutatsiyalar kuzatiladigan mtDNKdan farqli ravishda, Y-xromosoma polimorfizm makoni bo‘lib hisoblanadi, bu esa uni yanada axborotga boy qiladi[4].
Y-xromosomaning X-xromosoma bilan rekombinatsiyasi uning umumiy uzunligining 5% ini tashqil qiladigan uchki qismlarida amalga oshadi. Shu tariqa, Y-xromosoma o‘zgarmas holda otadan o‘g‘il farzandlarga va avloddan avlodga berib boriladi. Qayd etilgan xususiyatlar Y-xromosomadagi genetik markerlarni shaxs identifikatsiyasi (masalan, jins bilan bog‘liq bo‘lgan jinoyatlarni tergov qilishda) va ota avlod bo‘yicha qarindoshlikni aniqlashda qo‘llanilishi mumkinligini ko‘rsatadi.
Bugungi kunda Y-xromosomaning 200 dan ortiq STR lokuslari aniqlangan bo‘lib, ularning ba’zilari xromosomada 2 va hatto 3 nusxadan joylashgan.
Bugungi kunda qarindoshlikni aniqlash bo‘yicha tadqiqotlar o‘tkazuvchi ko‘pgina kriminalistik laboratoriyalar “Amp FISTR®Yfiler® Plus PCR Amplification Kit” to‘plami bo‘yicha tekshiruv o‘tkazmoqda[5]. Mazkur to‘plam 25 ta STR lokuslarni o‘z ichiga olib, yevropa va amerika standartlari bo‘yicha tasdiqlangan lokuslarni o‘z ichiga oladi.
DNK tahlil bosqichlari va usullari
DNK taxlilini o‘tkazishda biologik materiallardan turli xil DNK molekulalarini ekstraksiya (ajratish) va tozalash uslublari, ajratib olingan DNKni miqdoriy va sifat tahlili uslubi, DNK strukturasini aniqlash va uning maxsus qismlarini sintez qilish va ko‘paytirish uslublari, DNK genotipini aniqlash, dasturiy solishtirma tahlil qilish uslublari va boshqa zamonaviy molekulyar genetik uslublardan foydalaniladi
Kriminalistika amaliyotida DNK tahlil usullari ichida keng qo‘llaniladigani polimerazali zanjir reaksiyasi (PZR) va fragment tahlili bo‘lib hisoblanadi.
Polimerazali zanjir reaksiyasi
Tahlil usuli gipervariabel genetik markerlarni polimerazali zanjir reaksiyasi yordamida amplifikatsiya qilishga asoslangan[16]. Polimerazali zanjir reaksiyasi (PCR-Polymerase chain reaction) DNKning yarimkonservativ sintezi asosida, 1985 yilda G.Myullis tomonidan kashf etilgan va oradan 8 yil o‘tib Nobel mukofotiga sazovor bo‘lgan. Polimerazali zanjir reaksiyasi tahlil uchun kerakli bo‘lgan istalgan miqdordagi, hatto bir necha million martagacha bo‘lgan DNK ketma-ketliklarini ajratish va ko‘paytirish imkonini beradi. Bunday yuqori darajadagi yo‘naltirilgan usul DNK molekulasining juda kam miqdori bilan ishlash imkonini beradi, xususan, ekspertiza tekshiruvi uchun taqdim etilgan biologik material juda ham kam miqdorda bo‘lganda ham uni tipirlash imkoniyatini beradi. Bundan tashqari, PZR kuchli degradatsiya darajasiga uchragan parchalangan DNK molekulalarini tahlil qilishda o‘ta samarali hisoblanadi.
PZR murakkab fermentativ jarayon bo‘lib, yangi zanjir sintezlanishi uchun javobgar bo‘lgan ferment bu DNK-polimeraza fermentidir. Mazkur ferment DNK zanjirini uzaytirish xususiyatiga ega bo‘lib, bunda 5’-3’ yo‘nalishi bo‘yicha 3’ uchga bittadan nukleotid biriktirib boradi. DNK-polimereza mustaqil ravishda bir zanjirli DNK da sintez boshlay olmaydi, buning uchun kichik ikki zanjirli DNK qismi kerak bo‘ladi. Uni hosil qilish va sintezni boshlash uchun matritsali DNKga qisqa fragmentli bir zanjirli DNK (taxminan 20 juft nukleotid), ya’ni DNK tomizg‘i yoki praymer qo‘shiladi. DNK praymerning nukleotid ketma-ketligi matritsali DNKning ma’lum qismiga komplementar bo‘lishi kerak. Nukleozidtrifosfatlar (dNTP) DNK sintezi va reaksiya energiya manbai bo‘lib, bu reaksiya jarayonida ular ikkita oxirgi fosfat guruhlarini yo‘qotadi. Zanjirga qo‘shiladigan nukleotid tanlovi asoslar komplementarligiga ko‘ra amalga oshadi.
Polimerazali zanjir reaksiyasi DNK-polimeraza ishtirokida amplifikatsiya (nusxaalash) imkonini beradigan siklik jarayondir. Reaksiya jaryonida ushbu ketma-ketliklar yig‘ilib boradi va reaksiya so‘ngida millionlab miqdorga erishadi. DNKning amplifikatsiyalanuvchi chegaralari tekshirilayotgan ketma-ketlikning 3’ uchiga komplementar bo‘lgan ikkita praymerlar bilan belgilanadi[6].
Amplifikatsiyani o‘tkazish uchun quyidagi komponentlar kerak bo‘ladi:
DNK-matritsa (DNK yoki maxsus fragment tutuvchi uning bir qismi);
Praymerlar (aniqlanayotgan maxsus fragment chegaralaridagi DNK ketma-ketliklariga komplementar bo‘lgan sintetik sun’iy oligonukleotidlar). Maxsus fragment tanlovi va praymerni tanlab olish amplifikatsiyani o‘tkazishda muhim ahamiyat kasb etadi, bu uning analizini sifatli o‘tishini ta’minlaydi;
Dezoksinukleotidtrifosfatlar arashmasi (dNTF) (yangi komplementar DNK zanjirlarining sintezi uchun kerak bo‘lgan 4 ta dNTFlar aralashmasi);
Taq polimeraza fermenti (issiqlikka chidamli bo‘lgan DNK-polimeraza, u sintezlanayotgan DNK zanjiriga nukleotid asoslarini ketma-ket biriktirish yo‘li bilan praymer zanjirlarini uzaytirishni tezlashtiradi);
Bufer eritma (ferment faolligini ta’minlovchi Mg²⁺ ionlarini tutuvchi reaksion muhit)
DNKning kerakli bo‘lgan fragment imqdorini olish uchun amplifikatsiya bir necha siklda (20-40 sikl) o‘tkazilishi mumkin.
Har bir amplfikatsiya sikli turli harorat rejimlarida o‘tuvchi 3 bosqichni o‘z ichiga oladi:
: DNK denaturatsiyasi (ikki zanjirning uzilishi). 30-40 sek. davomida 93-95 ^oS haroratda o‘tadi.
: Praymerlarning birikishi (otjig). Praymerlar birikishi DNKning qarama-qarshi zanjirlaridagi mos ketma-ketliklariga komplementar tarzda amalga oshadi. Har bir praymer jufti uchun o‘zining birikish harorati bo‘lib, u 50-65^oS harorat o‘rtasida va 20-60 sek. vaqt oralig‘ida o‘tadi.
: DNK zanjirlarining qurilishi. DNK zanjirlarining komplementar tarzda qurilishi praymerlar birikkan qismlardan boshlab zanjirning qarama-qarshi yo‘nalishdagi 5’ uchidan 3’ uchiga qarab ketadi. Eritmaga dezoksiribonukleotidtrifosfatlar (dNTF) ning qo‘shilishi DNK yangi zanjirlarining sintezi uchun materal bo‘ib xizmat qiladi. Sintez jarayoni issiqlikka chidamli DNK-polimeraza (Taq-polimeraza) fermenti bilan tezlashtiriladi va 70-72 ^oS harorat o‘rtasida va 20-40 sek. vaqt oralig‘ida o‘tadi.
Amplifikatsiyaning birinchi siklida hosil bo‘lgan DNKning yangi zanjirlari DNKning fragmentlari hosil bo‘ladigan amplifikatsiyaning ikkinchi sikli uchun matritsa bo‘lib xizmat qiladi. Navbatdagi amplifikatsiya sikllarida amplikonlar yangi zanjirlar sintezi uchun matritsa bo‘lib xizmat qiladi. Shu tariqa, eritmadagi amplikonlar yig‘ilib borishi 2ⁿ formula bo‘yicha ketadi, bunda n-amplifikatsiya sikllarining soni. Shuning uchun, dastlab eritmada DNKning bitta ikki zanjirli molekulasi bo‘lsa, 30-40 sikl davomida eritmada taxminan 108 molekula amplikon yig‘iladi. Bu miqdor fragmentning ishonchli deteksiyasi uchun yetarli bo‘ladi. Amplifikatsiya jarayoni maxsus programmalashtirilgan termoboshqaruvli amplifikatorda o‘tkazilib, berilgan dastur bo‘yicha avtomatlashtirilgan holda amplifikatsiya sikllari soniga muvofiq haroratni o‘zgartirib turadi[7.
Amplifikatsiya jarayoni uchun multipleks amplifikatsion tizimlar-individuallashtiruvchi test to‘plamlar kerak bo‘ladi. Test tizim to‘plamiga reaksion muhit, maxsus praymerlar, DNK polimeraza va ledder kiradi.
Tadqiqotning navbatdagi bosqichida PZR mahsulotlarining denaturatsiyasi va elektroforezi o‘tkaziladi. Natijada tekshirilayotgan DNK namunasining allel profili-genotipi olinadi. PZR mahsulotlari avtomatlashtirilgan apparat-dasturiy kompleks-sevenatorda tahlil qilinadi.
DNK elektroforezi- DNKni o‘lchamiga (uzunligi) qarab fragmentlarga bo‘lish uchun qo‘llaniladigan analitik usul bo‘lib hisoblanadi. Namunalarga ta’sir etuvchi elektr maydonining kuchi DNK fragmentlarini gel orqali harakatlanishiga undaydi. DNK moekulasining saxarofosforli qismi manfiy zaryadlanganligi sababli DNK zanjirlari manfiy zaryadlangan katoddan musbat zaryadlangan anod tomon harakatlanadi (10-rasm). Uzun molekulalar gelda ushlanib qolganligi uchun nisbatan sekin, kaltaroq molekulalar esa tezroq harakatlanadi. DNK elektroforezi uchun odatda agarozali (DNKning nisbatan uzun molekulalari uchun) va poliakrilamid (DNKning qisqa molekulalarini aniqlash uchun, masalan, sevenirlashda) gellari qo‘llaniladi. Ajralishdan so‘ng (ba’zan bo‘yoq eritilgan agarozaga qo‘shiladi) turli xil uzunlikdagi DNK fragmentlari DNK bilan maxsus o‘zaro ta’sirlashuvchi flyuoressent bo‘yoqlari yordamida vizualizatsiya qilinadi, masalan, agarozali gellar odatda etidiy bromid bilan bo‘yaladi, bunda dupleksning azot asoslari o‘rtasida interkalyatsiyalanadi va UB nurlarida yorug‘lik tarqatadi. O‘lchamlarni aniqlash uchun ma’lum uzunlikka ega bo‘lgan DNK ketma-ket fragmentlarini o‘z ichiga olgan DNK fragmentlari markerlarini (DNA ladder, “lineyka”) o‘zaro solishtiriladi. Marker chiziqlarining va noaniq o‘lchamdagi DNK fragmentlari chiziqlarining joylashishiga qarab uning uzunligi aniqlanadi[6].
Bugungi kunda tekshirilayotgan DNKning fragment tahlili uchun maxsus avtomatlashtirilgan apparat-dasturiy kompleks-sekvinator va to‘plamlar komplektidan foydalanib poliakrilamid gelidagi elektroforez qo‘llaniladi. Zamonaviy sekvenatorlarni o‘tkaziladigan elektroforezni, kapillyar va ajralish gel plasstinkalarida o‘tadigan turlarga bo‘lish mumkin. Elektroforez o‘tkazishdan oldin DNKning maxsus qismlari besh yoki olti fluoressent bo‘yoqlari bilan belgilanadi va polilokusli formatda PZR o‘tkaziladi. Poliakrilamid gelidagi elektroforez jarayonida lazer nuri gelning ma’lum bir qismida bo‘yoqning fluoressensiyasini qo‘zg‘atadi va detektor ayni vaqtda qaysi fragment gel orqali harakatlanayotganini aniqlab beradi. Genom DNKning amplifikatsiyalangan fragment o‘lchamlari kompyuter dasturlari orqali hamda maxsus reagent to‘plamlaridan foydalanib aniqlanadi. So‘ng maxsus dasturiy ta’minot yordamida har bir allelning son ko‘rsatgichlari bilan ifodalangan grafik tasviri olinadi.