Biokimyo va molekulyar biologiya

Aptamerlarning o‘ziga xosligi
Aptamerlarning organizmga tezda moshlashadi hamada ayrim kasalliklarni davolashda keng qo'llanilishi bilan ajralib turadi. Aptamerlarni tanlash uchun eng yaxshi maqsad bu dissotsilanish konstantalari (Kd) katta bo'lgan aptamerlar komplekslarining oqsillari nanomolyar va pikomolyar diapazondagi oqsil nishonlari organizm uchun muqobil variyant hisoblanadi. Turli hil past molekulyar og'irlikdagi Kd odatda 10-6 dan 10-7 gacha bo'lgan aptamerlarning oqsil nishonlariga yuqori sezgirligi quyidagicha izohlanadi bunday komplekslarda aptamerning ta'sir qilish maydoni bilan maqsadli molekula ishlab chiqadi. Aptamerlarning o'xshash oqsillarni ajratish qobiliyati quyidagicha aniqlanadi. Agar aptamer oqsil bilan bog'langan bo'lsa oqsil molekulasiningo'zgaruvchan shaklga keladi, keyin o'zaro ta'siri ko'proq bo'ladi. Masalan OIV-1 virusi oqsilini OIV-2 virusi oqsili tanlab oladi, bu oqsillar faqat 65% gacha o'zgaruvchan bo'ladi . Proteinkinaza C aptamerlari fermentning chambarchas bog'liq izoformasi bilan ta'sir o'tkazadi, atigi 4% ga farq qiladi . Ayrim aptomerlar mutatsiyaga uchragantrombinga ta'siri natijasida ularning nukletidlarini o'zgartirish kiritadi , gepatit C virusi replikatsiyasida va OIV-1 virusining teskari transkriptazasida ishtirok etadi.
Aptamer konformatsiyalari
Aptamerlarning xarakterli xususiyati – ularning ikkinchi darajali strukturaning shakllanishi konservativ motivlarni tahlil qilish ѐrdamida, kompyuter modellashtirish va fermentativ tekshirish asosida o'rganiladi. Aptamerlarning liposomalar bilan o'zaro aloqasi - bu juftlashtirilmagan saytlar oligonukleotidlar. Barqaror ikkilamchi tuzilishga ega bo'lgan joylarda aptomerlarning elementar birligi o'zaro ta'sirini ta'minlash uchun zarur bo'lgan qismlari (oligonukleotid) asosida shakllanadi. Bundaaptamerlarning ko'plab saytlari ma'lumot tashish ekanligini tasdiqlaydi, bu bilan bog'langandan keyingina barqaror konformatsiyaga ega bo'lgan nishonto'qimaga yuboriladi . Aptamer odatda bitta ѐki ikkita strukturaviy shakllarda namoyon bo'ladi. Aptamerlarning o'ziga xos xususiyati juda xilma xilligi bilan bog'liq bo'lgan konformatsiyalar (soch turmalari, psevdo tugunlar va G-kvartetlar) (3-rasm), oligonukleotidlarni, funktsional guruhlarni o'zgartirish hisobiga vodorod ionlarini ko'chirish orqali konfarmatsiyalar hosil qilishda ishtirok etadi hamda elektrostatik va Van der Vaals kuchlari asosida funktsional guruhlar bilan o'zaro ta'siri molekulyardarajada sodir bo'lishi bilan yakunlanadi.



3-rasm. Aptamerlar tomonidan hosil qilingan ikkilamchi tuzilmalar:
1,4 - soch turmaklari, 2 - soxta tugun, 3 - G-kvartet
Proteinli aptamerlar ma'lum tashqi maydonlarini taniydilar bunday aptomerlar – epitoplar deyiladi . Oqsillarning joylashuviga ko'ra aptamerlar, tarkibida mavjud bo'lgan oqsillar holati va oqsillarningaptamerlar tomonidan tan olingan epitopni o'z ichiga olishi mumkin bo'lgan uch o'lchovli modellari ishlab chiqilgan va denanturatsiyaga tez kirushuvchan oqsillar ham aptomer hosil qiladi . Tanlangan ketma-ketliklarning aksariyati bitta va bir xil bo'ladi ѐlg'on tugunli tuzilishga ega va o'zaro ta'sir qiluvchi aptamerlarning bir xil sinfi fermentning tabiiy RNK-bog'lovchi markazi mavjuddir.
Kerakli xususiyatlarga ega aptamerlarni olish uchun SELEX texnologiyasi (tizimli
ligandlarning eksponensial boyitish orqali evolyutsiyasi) taklif qilindi . Bu usul
boshlang'ich modda sifatida oligonükleotidlar kutubxonasidan foydalanadi, ularning har biri .Oligonukleotid uzunligi 17-25 nukleotiddan iborat umumiy 3' va 5' yon tomonlarga ega vauzunligi 20-60 nukleotid bo'lgan o'rta hududlar noyobdir. Bunday kutubxona bo'lishi mumkinoligonükleotidning bitta preparati sifatida sintezlanadi, unda to'rttasining har birinukleotidlar har bir pozitsiyada o'rta qismga teng ehtimollik bilan kiritilgan. Bupreparat maqsadli molekula bilan inkubatsiya qilinadi, bu odatdaba'zi mustahkam tayanchga o'rnatiladi. Bog'lanmaydigan oligonükleotidlarmaqsad olib tashlanadi va bog'laydiganlar PCR orqali kuchaytiriladi umumiy 3' va 5' qanotlari yordamida. Ushbu tsikl bir necha marta takrorlanadi, natijadamaqsadli molekulaga yaqin bo'lgan ketma-ketliklar bilan boyitish.Nihoyat, aptamer molekulalari plazmidlarning bir qismi sifatida va alohida-alohida klonlanadixossalari uchun sinovdan o‘tkazildi. Ushbu texnologiya aptamerlarni olish imkonini beradiikki haftadan bir necha oygacha. SELEX-dan foydalanish tajribasi shuni ko'rsatdiaptamerlarni deyarli har qanday maqsad uchun olish mumkin: oqsillar, polisakkaridlar, kichik organik molekulalar, viruslar va butun hujayralarShuni ta'kidlash kerakki, SELEXda ishlatiladigan oligonukleotid kutubxonalari bunday emas DNK yoki RNK molekulalarining to'liq spektrini o'z ichiga oladi. Odatda, bunday kutubxonalar o'z ichiga oladi. Taxminan 10–8–10–10 M oligonükleotidlar yoki 1014–1016 molekulalarga mos keladi.uzunligi 25 (425 ≈ 1015) bo'lgan oligonukleotid variantlari soniga. Shunday qilib, 25 dan ortiq tasodifiy tumanga ega kutubxonalar juda kam ifodalangan.Bu mutagen SELEX tomonidan aptamerlarni yanada takomillashtirish imkoniyatini ochadi.
Ushbu protsedura an'anaviy SELEX dan faqat har bir tsiklda bo'lishi bilan farq qiladi aptamer tarqalishi, an'anaviy emas, balki mutagen PCR qo'llaniladi. Shunday qilib, shunday aptamerlarni "nozik sozlash" va ularning yaqinligi yoki o'ziga xosligini oshirish mumkinAptamerlarni monoklonal antikorlarning analoglari deb hisoblash mumkin. Biroq, ular antikorlarga nisbatan bir qator muhim afzalliklarga ega. Ularning ishlab chiqarilishi monoklonal antikorlarni ishlab chiqarishga qaraganda ancha oson, arzonroq va tezroq. Ular ancha kichikroq va shuning uchun to'qimalar va hujayralarga osonroq kirib boradi va mumkin yuqori yaqinlik va o'ziga xoslikka ega.
Aptamerlar quyidagi tadqiqot, diagnostika va terapevtik vazifalarni bajarishda qo'llanilishi mumkin:
1. Ilmiy va diagnostikada turli maqsadli molekulalarni aniqlash uchun
vazifalar. Ular g'arbiy blotting, in situ floresansida antikorlarni almashtirishi mumkin gibridizatsiya va Elishay da.
2. Diagnostika uchun istiqbolli format - ko'plab aptamerlar bilan chiplarni yaratish
va bir vaqtning o'zida ko'plab oqsillarni aniqlash imkoniyati.
3. Maqsadli molekulalarning yaqinlik bilan tozalanishi uchun.
4. Maqsadli oqsillarni samarali va o'ziga xos inhibe qilish uchun. Bunday inhibisyondan foydalanish mumkintadqiqot maqsadlarida ham, yangi dori vositalarini yaratish uchun ham. Ushbu dorilarning ba'zilari allaqachon klinik sinovlarda.
5. Aptamerlarni qo'llashning istiqbolli yo'nalishi - yo'naltirilgan dori vositalari. Aptamerlar bu holda etkazib berish maqsadini aniqlang (maqsadli ligandlar)