Amaliy enzimologiya

Ish 2 bosqichda amalga oshiriladi. 
1-bosqichning maqsadi-o'simlik to'qimalarida peroksidaza (PO) faolligini 
aniqlash; uning qiymatini turli xil o'simlik turlarida solishtirish. 

---

2 - bosqichining maqsadi-enzimatik reaktsiyaning kinetik xususiyatlarini 
aniqlashdan iborat. 
Reagentlar va materiallar:
o'simlik materiallari (yuksak o'simliklarning barglari 
yoki ildizlari); pH 6,7, distillangan suv bilan fosfat buferi; 100 ml hajmdagi o'lchov 
kolbasi, chinni hovoncha, filtr qog'ozi,
Asbob uskunalar
: Sekundomer, FEC, λ 460 nm bo’lgan yorug'lik filtri, 2 sm ish 
masofasi bo’lgan uchta kyuveta. 
Ishning borishi.
1.
200 mg (aniq massa yozilishi kerak) bo’lgan o'simlik materialini oz 
miqdordagi (taxminan 5 ml) 0.06 m fosfat buferi, pH 6,7 bilan chinni 
hovonchada maydalanadi. 
2.
Maydalangan massani 100 ml hajmdagi o'lchov kolbasiga o’tkazilib, ayni 
buferda chizig’igacha etkazilib, yachshilab aralashtiriladi va 15 daqiqa 
davomida qoldiriladi. 
3.
Keyin eritma ikki qavatli qog'oz filtr orqali filtrlanadi. Filtrat (ekstrakti) 
ferment faolligini aniqlash uchun ishlatiladi. 
4.
Ferment faolligi 460 nm da FEK bilan o'lchanadi.
5.
Optik zichlikni o'lchash uchun 8 ml (nazorat va ikkita kimyoviy takrorlash) 
uchun uchta kyuveta ishlatiladi. Uchta kyuveta har birigaa: 0,3 ml o-
dianisidin, 1 ml 0,06 m fosfat buferi, pH 6,7, 1 ml ekstrakt solinadi. Shundan 
so'ng, 2 ml distillangan suv nazorat kyuvetasiga solinib, FEK ga o’rnatiladi va 
tegishli nur beriladi. 
6.
Qo’l bilan qo'pol va aniq sozlash tugmalaridan foydalanib “0” optik zichlikni 
nazorat kyuvetasida qayd etiladi. 
1.
Eksperimental kyuvetalardan birini FEK'a ichiga o'rnatilib va yorug'lik 
nuri beriladi.
2.
Avtomatik pipetka yordamida 1 ml 0,3% vodorod peroksid eritmasi sinov 
kyuvetasiga solinadii va shu bilan bir vaqtda sekundomer yoqiladi. 
3.
Absorbsiya qiymatlarini har 20 soniyada yozib olinadi. 
4.
7 - 10 ballni nuqtani qayd etish kerak.
5.
Xuddi shu tarzda, ikkinchi tajriba kyuvetasida optik zichlikning 
o'zgarishini o'lchanadi. 
t vaqtga bog’liq optik zichlik D460 grafigi quriladi. Grafikda chiziqli kesma 
(AB)ni topib va optik zichlikning o'zgarishi tezligi hisoblanadi: D460 = (D460B - 
D460A) / (tB - tA). (D440 raqamli birliklar bo’yicha hisoblanadi, grafikdan 
o'lchanmaydi!). 
Peroksidaza (APO) faolligi quyidagi formula bilan hisoblanadi:

---

bu erda: 
D460 - optik zichlikning o'zgarishi darajasi [op.zich. birligi / sek]
N – suyultirish darajasi.
- namunaning xo’l og'irligi [g]
l kyuv. - kyuveta qalinligi [sm]; (bu tajribada l = 2 sm). 
O'lchashlarni 
(1-bandga 
qarang) 
substrat 
(o-dianisidin) 
ning 
turli 
konsentrasiyalarida bajariladi. 
3.
Fermentativ reaksiya tezligi v ni mollar / sek (M / sek) ni substratning turli 
konsentratsiyalarida [S], (M) da hisoblanadi.
4.
Qaytar qiymatlarni hisoblanadi: 1 / v, (M-1 · s) va 1 / [S], M-1. 1 / [1] ga 
nisbatan grafigini tuziladi [S]. 
Reaksiyaning kinetik tavsifi: reaksiya tezligining substrat konsentratsiyasiga 
bog’liqligi
№ п/п
[S]
(М) 
1/[S]
М-1 
v
Моль/сек 
(М/с)
1/v
(М-1·с)
Mixaelis 
Konstantasi 
Km 
5.
berilgan misolga ko'ra, Mixaelis Konstantasi Km va Vmax ni ikki 
tomonlama teskari qiymatlar (Laynuiver-Berk usuli) bilan aniqlanadi.
Xulosa:

---

 a) hisoblangan ferment faolligini ko'rsating, turli organlarda / o'simlik 
turlarida ferment faolligini solishtiring, o'simlik to'qimalarida ferment 
funktsiyalari haqidagi ma'lumotlar asosida mumkin bo'lgan farqlarning 
sabablarini tushuntiring; 
b) kinetik xususiyatlarni ferment faoliyati bilan solishtirish.